头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠脑组织AQP4表达的影响*

刘婷婷，朱文增，金 弘，黄日龙

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2.中国中医科学院广安门医院，北京100053; 3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;4.安徽省中医院，安徽合肥230031)

头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠脑组织AQP4表达的影响*

刘婷婷1，朱文增2△，金 弘3，黄日龙4

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2.中国中医科学院广安门医院，北京100053; 3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;4.安徽省中医院，安徽合肥230031)

目的:研究头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用机制。方法:采用改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。将Wistar雄性大鼠，随机分成3组:假手术组、模型组、头穴丛刺组。各组随机分成6 h、1 d、2 d、3 d共5个时间点，采用免疫组织化学技术检测大鼠脑缺血再灌注后AQP4蛋白表达变化及头穴丛刺法治疗对它们的影响。结果:免疫组化结果显示与模型组比较，头穴丛刺组损伤侧脑组织AQP4蛋白表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。结论:头穴丛刺法能够调节AQP4的表达，减轻由于再灌注损伤导致的血脑屏障通透性增强，从而减轻脑水肿，在脑缺血再灌注早期起到挽救和保护受损神经元、改善神经功能的治疗作用。

脑缺血再灌注;头穴丛刺法;脑水肿;水通道蛋白－4

缺血性脑血管病以其高发病率、高致残率和高死亡率严重影响着人们的健康。恢复缺血脑组织的血流灌注是治疗脑缺血的前提，但再灌注过程中会继发多种脑组织损伤。经过多年的研究，针刺在治疗脑缺血急性期和后遗症神经元保护方面取得了重要进展，头穴丛刺法治疗在临床上取得极好的疗效。本研究拟从分子水平探讨头穴丛刺法对脑缺血再灌注损伤后血脑屏障功能恢复和脑水肿的防治机制，证实头穴丛刺法在改善神经功能、促进神经再生、血脑屏障修复和功能重建等方面的优势，为临床上进一步采用头穴丛刺法治疗脑梗死提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性清洁级Wistar大鼠180只，体质量(250± 20)g，鼠龄4～5个月，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(动物生产许可证编号:黑动字第P00102008)。大鼠自由进食、饮水，同等条件下适应性饲养1周，手术前12 h禁食不禁水。按随机数字表法将动物随机分成3组:假手术组、缺血再灌注模型组(以下简称模型组)、缺血再灌注后头穴丛刺治疗组(以下简称头针组)。各组随机分成6 h、1 d、2 d、3 d、5 d共5个时间点，每个时间点12只动物。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备

采用改良的Zea Longa法［1，2］制作右侧大脑中动脉阻塞(脑缺血)再灌注模型。

栓线制备［3］:把直径0.234 mm的日本产钓鱼用尼龙线(日本渔具株式会社)切割成长约5.0 cm的小线段，将其一端快速闪过火焰烧制成光滑球形，选用表面光滑、断面平直及球体直径约为0.25 mm的线栓，在离球端3 cm处标记，75%酒精清洁处理，浸泡于125 mg/dl肝素生理盐水中，置于4℃冰箱内备用。

模型制备过程:10%水合氯醛35 mg/kg腹腔麻醉，颈部正中切口，自胸骨角到距离鼠下唇1.0 cm处，剥离暴露右侧颈总动脉1～1.5 cm，近心端丝线结扎，并结扎右侧颈外动脉。颈总动脉切口，栓线插入18～20 mm，将栓线经颈内动脉送至大脑中动脉起始处，逐层缝合。脑缺血2 h后，轻轻回撤栓线，实现脑缺血再灌注。术中及术后维持动物肛温在(37±1)℃，术后分笼饲养，自由饮食饮水。

1.2.2 取穴及针刺方法

参照《实验针灸学》［4］取大鼠的百会穴和百会穴左右旁开2 mm共3个穴位。

假手术组:手术时把尼龙栓线仅插入颈总动脉6 mm左右而不入颅;术后不给予任何治疗。

模型组:造模后，不给予任何治疗。

头针组:待动物评分后开始给予头穴丛刺治疗，每日针刺1次，用0.35 mm×25 mm毫针从后向前平刺大约6～8 mm，每次留针30 min，每15 min捻针1次，频率为200转/min左右，每次持续捻转3 min。

1.3 观察项目及方法

1.3.1 动物神经系统体征的观察与评分标准

参照Zea Longa的5级评分标准［1］，所有动物再灌注完成后6 h，进行第1次神经功能缺损评分，以后分别于再灌注后1 d、2 d、3 d、5 d时进行神经功能评分。0分:无神经缺损症状，活动正常;1分:不能完全伸展左侧前肢，轻度局灶性神经功能缺失;2分:行走时身体向左侧转圈，中度局灶性神经功能缺失;3分:行走时身体向左侧倾倒，重度局灶性神经功能缺失;4分:不能自发行走，意识水平丧失。

造模后对其进行初选，保留神经功能评分在1～3分的大鼠。造模及针刺过程中死亡的大鼠予以剔除，按随机数字表补入。密切观察造模大鼠的各项体征，详细记录。

1.3.2 免疫组化法检测AQP4蛋白的表达

AQP4在星形胶质细胞及血管周围呈棕黄色为阳性表达。免疫组化染色切片图像结果分析方法:采用Motic Med6.0图像分析系统，每组选6张切片，利用显微摄像系统，每张切片在400倍下随机选取缺血区5个非重叠视野，AQP4计算阳性显色的面积百分比，取其平均值进行统计学分析。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 实验各组大鼠神经功能缺损评分比较

见表1。模型组在2 d时神经功能缺损评分显著高于6 h、1 d(P=0.001，0.041＜0.05)，随后开始下降，在5 d时明显优于2 d评分，具有显著性差异(P= 0.001＜0.05)，但与3 d、6 h差异不显著。可见在缺血再灌注6 h～2 d，神经功能缺损有所加重，随着缺血时间的延长，模型组大鼠神经功能缺损在一定程度上存在着自发性恢复的趋势。头针组在3 d时神经功能缺损评分明显减少，与2 d、1 d时比较，具有显著性差异(P=0.001，0.047＜0.05)，但与6 h比较，无显著性差异(P=0.370＞0.05)，至5 d时评分减少程度更明显，分别优于6 h、1 d、2 d、3 d(P=0.003，0.001，0.001，0.001＜0.05)。

与假手术组比较，大鼠脑缺血再灌注后不同时间点模型组、头针组均出现不同程度的神经功能缺损，两两比较具有显著性差异(P＜0.05);头针组在术后6 h、1 d、2 d与模型组比较无显著性差异(P=0.294，0.533，0.264＞0.05)，3 d、5 d时均可见神经功能缺损评分减少，头针组明显优于模型组，具有显著性差异(P=0.003，0.001＜0.05)。说明头穴丛刺法能够促进脑缺血大鼠神经功能的恢复，减轻神经功能缺损症状。

2.2 头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠缺血侧脑组织AQP4表达的影响

见表2。假手术组大鼠AQP4主要在皮层、皮层下白质及纹状体区的毛细血管壁、胶质细胞的胞膜表达，而在神经元则未见表达。模型组AQP4表达随时间的推移而发生一定变化，在1 d时降至最低，随后逐渐回升，个别大鼠在海马锥体细胞层出现阳性表达。头针组也可见AQP4表达，与假手术组较为接近。

模型组在6 h缺血侧脑组织中AQP4表达有所下降，1 d时缺血侧脑组织中AQP4表达降至最低，与6 h时比较，具有显著性差异(P=0.001＜0.05);从2 d开始逐渐恢复，3 d时脑组织中AQP4表达明显高于1 d (P=0.001＜0.05);5 d时脑组织中AQP4表达继续回升，接近正常数值，但显著高于1 d(P=0.001＜0.05)，且与3 d相比，有显著性差异(P=0.001＜0.05)。

与假手术组比较，大鼠脑缺血再灌注后6 h、1 d、2 d、3 d模型组AQP4表达均出现不同程度的改变，两两比较具有显著性差异(P＜0.05);头针组在再灌注后6 h与模型组比较无显著性差异(P=0.275＞0.05)，1 d、2 d、3 d、5 d时头针组AQP4表达虽有明显回升，但1 d、2 d、3 d、5 d时AQP4表达明显低于同时间点模型组，具有显著性差异(P=0.035，0.049，0.007，0.001＜0.05)。

表1 实验各组大鼠神经功能缺损评分 (±s)

表1 实验各组大鼠神经功能缺损评分 (±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手术组组别 例数120 0 0 0 0模型组 12 1.83±0.49*2.29±0.39*2.67±0.33*2.25±0.40*1.96±0.54*头针组 12 1.67±0.44*2.21±0.40*2.54±0.33*1.83±0.39＊△1.08±0.63＊▲

表2 头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠缺血侧脑组织AQP4表达的影响 (%，±s)

表2 头穴丛刺法对脑缺血再灌注大鼠缺血侧脑组织AQP4表达的影响 (%，±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手术组 6 7.43±0.54 7.53±0.44 7.55±0.59 7.57±0.62 7.组别 n 51±0.65模型组 6 5.56±0.56*3.89±0.55*4.33±0.42*5.94±0.63*7.35±0.53头针组 6 5.40±0.54*3.61±0.53＊△4.08±0.40＊△5.53±0.49＊▲5.71±0.47＊▲

3 讨论

近年来研究发现，水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族中的AQP4可介导水跨膜的双向运动，参与血浆渗透压的调节、血脑屏障的发育和功能维系，并兼有细胞外渗透压感受器的功能，对维持脑内水平衡至关重要，与脑水肿有着密切的关系［5～6］。

本研究发现的AQP4水平或活性主动降低正是机体从微观上对脑水肿和血脑屏障损伤的一种保护性反应。其可能的作用机制是:缺血再灌注损伤后，细胞间隙中增高的K+、H+以及以谷氨酰胺为首的一系列兴奋性氨基酸浓度上升，由此刺激胶质细胞启动激活细胞内信号传导系统［7］，并导致蛋白激酶 C活性升高［8］，激活的蛋白激酶C对AQP4进行磷酸化反应，AQP4经磷酸化后其生物活性丧失［9～11］，从而在一定程度上减少经由破坏的血脑屏障进入脑组织细胞间隙以及经胶质细胞膜进入细胞内的水分子的量，从而达到减缓脑水肿的目的。但是当局部区域的各种有害物质逐渐增多，细胞外间隙中的H+、Na+、K+、Cl－、兴奋性氨基酸浓度继续升高到一定水平时，这时胶质细胞将对此作出另一方向的调节以缓冲正在急剧恶化的细胞外液环境，这时的胶质细胞在增加清除K+的同时，将通过提高包括AQP4在内的多种AQPs表达水平和活性［12］，以增加遭受破坏的血脑屏障对水分子的通透，增加细胞外间隙水含量，从而降低细胞外液中有害物质的浓度，达到进一步保护神经元功能的目的。已有证据［13］提示脑组织中AQP4可能调节脑脊液的形成及细胞外液的容积的变化。本实验结果进一步证实AQP4与脑缺血性脑水肿的形成有关。与近年来国内外的动物实验及临床观察的研究结果一致［14～15］。

本课题是针灸专家于致顺教授头穴丛刺系统研究的总结与深化，其可能的作用机制是:在头部相应治疗区进行“丛式”针刺，间断行针，针刺每一穴位后，在所针刺穴位处产生了一定的生物磁场，多个场相互作用并增强场的效应，通过传导系统(经络、神经)作用于人体相应的部位，增强对身体相应部位的作用。这种生物磁场还可以直接的穿透高阻抗的颅骨作用于大脑皮层，改善脑血流，促进水液循环及物质代谢，从而利于水肿的消除，并能产生相应的神经冲动，改善神经冲动的传导，促进神经恢复。这样的针刺方法从针刺部位上来说，使对头部的刺激由原来点状刺激或线状刺激扩展到了面状刺激，增加了针刺的刺激面积［16～17］，同时也增加了刺激量，从而体现出头穴丛刺法相比于其它头针疗法的治疗优势。

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The Effect of Cluster Acupuncture on Scalp Points on AQP4Expression in Cerebral Ischemica Reperfusion Rats

LIU Ting－ting1，ZHU Wen－zeng2△，JIN Hong3，HUANG Ri－long4
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China; 3.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 4.Anhui Provincial Hospital of Chinese Medicine，Hefei 230031，China)

Objective:To explore cerebral protection mechanism of cluster acupuncture on scalp points (CASP)in cerebral ischemia reperfusion(CIR)rats.Methods:Focal cerebral ischemia was induced by intraluminal middle cerebral artery occlusion(MCAO)method using a monofilament thread in rats.Male Wistar rats were divided randomly into three groups:sham group、model group、and CASP group;each group was separated into 6 h，l d，2 d，3 d，5 d after reperfusion as subgroup for investigation.The expression of AQP4protein in CIR rats were measured by immunohistochemical method and the influence of the expression by CASP was observed.Results:Immunohistochemistry results indicated that compared with model group，the expression of AQP4has been significantly increased in CASP group(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:CASP method can regulate AQP4expression to reduce BBB permeability to prevent cerebral edema，through reducing cerebral edema，CASP method can save and protect damaged neurons，improve nervous function at early stage of CIR.

Cerebral ischemia reperfusion;Cluster acupuncture on scalp points(CASP);Cerebral edema; AQP4

R246.1

A

1005－0779(2012)008－0055－03

2012－01－15

黑龙江省自然科学基金项目，编号:2006D－61。

刘婷婷(1979－)，女，讲师，主要研究方向:针刺治疗神经系统疾病的研究。

△通讯作者:朱文增(1971－)，男，副主任医师，主要研究方向:头针防治中风和中医临床评价。