Nodal在肝细胞癌组织的表达与意义*

王修军 荚卫东 许戈良 刘文斌 任维华 李建生 张传海 马金良 余继海 葛勇胜

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是人类多发的恶性肿瘤，其发病率居第六位，在全球肿瘤相关死亡原因中居第三位[1]。Nodal是一个在胚胎发生中正常表达的形态发生因子，属于转化生长因子-β（Transforming growth factor beta，TGF-β） 家族中的重要成员，在一定的情形下，它能够诱导正常组织上皮细胞丢失原先存在的顶面-底面极性，变成具有间质细胞形态和特性的细胞，失去细胞间的紧密连接和粘附连接功能，使得细胞获得了浸润性和游走迁移能力，即上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）现象[2，3]。因此，Nodal是引起肿瘤转移与复发的基础因素之一。此外，线性基因组系列分析显示，Nodal的表达限于胚胎组织、人胚胎干细胞和癌组织细胞[4]。目前，已发现Nodal在转移性黑色素瘤、睾丸癌移植瘤和侵袭性乳腺癌细胞株中存在表达[5]。但在HCC组织中是不是也存在表达，尚未见报道。本课题对Nodal在人肝癌组织的表达及其意义进行了研究。

资料与方法

一、一般资料 选取2004年1月～2009年7月在我科行手术治疗的肝癌患者95例，其中男性68例，女性27例，年龄23～81岁，平均年龄52.3±1.7岁。参考国际抗癌联盟（UICC）2002年第六次修订的TNM分期标准，TNMⅠ/Ⅱ 43例，TNM Ⅲ/Ⅳ 52例；按照Edmondson分级法进行病理学分级，Ⅰ/Ⅱ 37例，Ⅲ/Ⅳ 58例。20例癌旁肝组织及12例行手术治疗的门脉高压患者肝活检组织作对照。

二、Nodal蛋白的检测方法 采用免疫组织化学SP二步染色法。组织切片经60℃温箱烤片30分钟，二甲苯重复脱蜡后，酒精依次脱水，自来水漂洗；PAP生物笔组织圈定后，3%去离子H2O2孵育，消除内源性过氧化物酶；枸橼酸盐缓冲液抗原热修复。PBS冲洗后，滴加鼠抗人Nodal单克隆抗体（台湾Abnova公司）50μL，工作液浓度为1:100。37℃孵育2h或4℃孵育过夜；滴加SP二步法通用型二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育后PBS冲洗，光学显微镜下DAB显色，苏木素复染，无水酒精重复脱水后二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。实验中以PBS代替一抗，作为阴性对照。细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。随机选取10个高倍镜（400×）视野，每个视野内计数100个细胞，观察镜下阳性细胞的数目。阳性细胞＜25%为阴性，25%～75%为弱阳性，75%以上为强阳性[6～8]。

三、统计学方法 应用SPSS13.0软件包，率的比较采用x2检验和Fisher精确概率计算。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、肝组织Nodal的表达 肝组织Nodal蛋白阳性表达处可见胞质或胞膜棕黄色。结合文献得知[9～12]，组织呈腺样型、梁索型排列等即为癌组织的典型特点。癌细胞间纤维组织、血管等未见表达；坏死组织和浸润炎性细胞未见表达。以癌组织中Nodal表达最为明显（59/95），呈强阳性反应（＞75%），且多数阳性肝癌细胞为弥漫散在分布，少数阳性细胞聚集呈强阳性，部分癌巢中呈局灶型高表达。且癌细胞排列结构越混乱，异型性结构越明显，阳性细胞便越集中、染色越深，数目越多。异型性小的细胞中Nodal蛋白表达较弱（着色区域相对较少，染色浅）。大多数癌旁组织和肝硬化组织中Nodal蛋白不表达，少数癌旁组织可见弱阳性表达，但染色浅，阳性细胞数目较少。癌旁肝组织和肝组织阳性率分别为20.0%和16.7% ，两者间差异无统计学意义（P＞0.05，图 1 A、B、C及表1）。

图1 A Nodal在肝炎肝硬化组织中的阳性表达量较少，染色浅

图1 B Nodal在癌旁肝组织中的表达 细胞质有少量黄染，且着色较浅

图1 C Nodal在癌组织中的表达 可见细胞质或细胞膜大部区域黄染，且着色深，组织结构异型性明显

表1 各组织Nodal蛋白的表达（%）

二、肝癌组织Nodal表达与临床病理特征间的关系 在肝癌组织中，Nodal表达主要与肿瘤的血管侵犯、肿瘤大小、肿瘤的分级和分期有关，而与年龄、性别等指标无关。Nodal阳性表达的患者，肿瘤直径大、血管侵犯率高、Edmondson分级高、pTNM分期晚（P＜0.05，表2）。

表2 肝癌组织Nodal表达与临床和组织病理学指标之间的关系

讨论

肝细胞癌是人类多发性恶性肿瘤，国内多名专家学者已从分子蛋白水平对肝细胞癌的发生发展机制展开了研究，并取得了一定的进展[13，14]。但是，由于肿瘤发生机制的复杂性，人类攻克肝细胞癌的努力仍在艰难行进中。Nodal是一种与人类肿瘤发生发展过程密切相关的蛋白[15，16]，它在恶性肿瘤中存在表达。目前，Nodal在侵袭性乳腺癌细胞株、睾丸癌移植瘤和转移性黑色素瘤中的表达已相继被报道[5，17]。然而，Nodal在肝癌中是否表达至今未见报道。我们采用的免疫组织化学染色法研究提示，Nodal蛋白在肝细胞癌中存在高表达，且癌细胞排列结构越混乱、异型性越明显，阳性染色越深，显示表达越强。同时，Nodal蛋白在大多数肝硬化和癌旁组织中无表达，仅极少数组织存在弱阳性表达。因此可以推断，Nodal在肝细胞癌的发生发展过程中扮演了重要角色[9，18，19]。研究结果还表明，肝癌组织Nodal蛋白的表达主要与肿瘤的血管侵犯、肿瘤大小、肿瘤的分级和分期有关，而与年龄、性别等指标无明显相关性。

EMT调节基因Nodal可能与肝细胞癌的发生发展有关，是表达于肝细胞癌中一个重要的新蛋白。随着该领域研究的深入，Nodal可能会成为肝恶性肿瘤发生发展的重要预测指标，为临床中制定更科学的肝细胞癌诊疗方案提供一定的理论支持。

（安徽省立医院肝脏外科王伟、陈浩、盛茂林、董训忠、刘国岩等医师在本课题的实施过程中给予了大量无私的帮助，在此一并致谢）

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