慢性丙型肝炎患者外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4的表达及其临床意义*

刘海莉 张 野 李 颖 白雪帆 贾战生 王九平

新近研究发现，E3泛素连接酶家族成员Casitas B-lineage lymphoma-b（Cbl-b）调控着外周血T细胞的活化阈值和CD28共刺激信号通路，可能在复杂的免疫网络调控中处于重要的地位[1]，Cbl-b的表达水平改变对T细胞功能也会产生重要的影响，高水平表达的Cbl-b可诱导T细胞免疫无功能，发挥负性免疫调控作用，可能导致机体的免疫耐受[2，3]。但是，尚无有关Cbl-b与HCV感染慢性化的相关研究报告。本研究通过对慢性丙型肝炎患者外周血Cbl-b及其相关调控信号分子CD28和细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）水平的测定，以探讨HCV感染慢性化的机制。

资料与方法

一、资料来源 2010年11月至2011年6月我科收治的慢性丙型肝炎患者25例，男性12例，女性13例，平均年龄43.6±11.8岁。所有患者抗HCV均为阳性，HCV RNA载量范围为 70100copies/mL～1470000copies/mL，ALT水平范围为 23U/L～92 U/L，其中HCV 1b基因型11例，HCV 2a基因型14例。诊断符合2000年中华医学会西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准[4]，排除其他肝炎病毒合并感染及合并自身免疫性、酒精性和药物性肝病，排除肿瘤、心血管疾病及其它感染性疾病。所有患者均未接受过抗病毒和免疫调节剂治疗。另选健康人19例作为健康对照，男性9例，女性10例，平均年龄35.6±4.7岁。所有健康志愿者血清HCV RNA和抗HCV均为阴性，ALT水平均＜40U/L。本研究方案经我院伦理委员会审批备案，所有入组患者和健康志愿者均签署知情同意书。

二、临床指标检测 采用荧光定量RT-PCR法检测HCV RNA（深圳匹基生物技术开发有限公司）；采用INNO-LiPA线性探针杂交法检测HCV基因分型（比利时Innogenetics公司）；采用日本奥林巴斯全自动生化分析仪检测肝功能（英国郎道公司）。

三、外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC）分离 应用EDTA抗凝管采集入组患者和健康志愿者外周静脉血20mL，2小时内应用美国Sigma公司生产的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法分离PBMC，调整细胞数至107个/管，冻存于液氮中备用。检测前24小时复苏细胞，调整细胞数至5×106个/mL，于37℃、5%CO2条件下在含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。

四、反转录荧光定量PCR检测Cbl-b、CD28和CTLA-4的表达 收集细胞，使用美国Invitrogen公司的Trizol试剂参照说明书提细胞总RNA，用DEPC处理的去离子水溶解RNA并进行定量。取1μg总RNA，使用大连TaKaRa公司反转录试剂盒应用随机引物合成cDNA。以cDNA为模版，加入引物（表1）和大连TaKaRa公司SYBR Master Mix荧光定量PCR试剂盒对相应的目的基因进行扩增，预变性95℃ 15秒后，95℃ 5秒、60℃ 30秒，共45个循环。应用2－ΔΔCT法对目的基因进行相对定量分析。

表1 寡核苷酸引物序列

结果

一、健康人和慢性丙型肝炎患者PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA相对表达水平的比较 慢性丙型肝炎患者外周血PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平均较健康对照组分别升高1.38倍、1.90倍和2.68倍（图1），其中，CTLA-4在慢性丙型肝炎组中的升高与对照组相比，差异具有统计学意义（t=2.314，P=0.028）。

图1 两组PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA相对表达水平

二、Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平与临床指标的相关性分析 在慢性丙型肝炎患者中，HCV 1b基因型患者外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平较2a基因型分别升高1.74倍、1.51倍和2.81倍，其中 Cbl-b（t=2.241，P=0.04）和 CTLA-4（t=2.569，P=0.022）的升高具有统计学意义（图2）。但是，Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平与HCV RNA及ALT水平均无显著相关性（Cbl-b与HCV RNA：r=-0.343，P=0.301；Cbl-b 与 ALT：r=-0.106，P=0.756；CD28 与HCV RNA：r=-0.009，P=0.979；CD28 与 ALT：r=-0.459，P=0.156；CTLA-4 与 HCV RNA：r=-0.484，P=0.131；CTLA-4 与 ALT：r=0.469，P=0.145）。

讨论

泛素是一种含有76个氨基酸的肽段。Cbl-b是E3泛素连接酶的重要成员，可作为衔接分子与细胞表面受体、细胞内蛋白或某些重要的信号分子结合，控制抗原受体活化的阈值和CD28共刺激信号的负性调控[4，5]。

Cbl-b在一些感染性疾病中也发挥重要作用。Cbl-b和CTLA-4在HIV感染者PBMC中表达均上调，同时，作为T细胞活化的上游负性调控分子，Cbl-b的表达上调使T细胞活化的阈值升高，CD4+和CD8+细胞对抗CD3单克隆抗体均不产生反应，细胞增殖能力下降，导致T细胞反应下降或失能[6]。蠕虫或丝虫感染者CTLA-4上调和转化生长因子β（TGF-β）刺激后Cbl-b水平升高，可能导致感染后T细胞低反应性[7，8]。我们的研究发现，慢性丙型肝炎患者PBMC中Cbl-b、CD28和CTLA-4均具有表达上调的趋势，但仅有CTLA-4的升高与对照组相比具有统计学意义。由于CTLA-4是CD28的拮抗分子，可通过与B7分子的高亲和力结合，竞争性抑制CD28与B7分子的相互作用，抑制T细胞活化的第二信号。而Cbl-b的表达受CD28和CTLA-4的精密调节，B7分子与CD28结合可诱导Cbl-b泛素化并降解，降低细胞内Cbl-b水平，增强T细胞增殖；相反，B7分子与CTLA-4结合则可上调Cbl-b表达，从而抑制T细胞增殖[9]。

进一步的研究也发现，虽然Cbl-b、CD28和CTLA-4的表达与HCV RNA和ALT水平没有显著相关性。但是，在HCV 1b基因型患者PBMC中Cbl-b和CTLA-4表达则显著高于HCV 2a基因型患者。干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者HCV病毒清除率在1型HCV感染者中较2型或3型HCV感染者明显偏低，而我们既往的研究也发现HCV 1b基因型患者外周血调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）水平较HCV 2a基因型患者显著升高，提示HCV 1b基因型感染者机体处于较强的免疫耐受状态，T细胞反应性较低。而CTLA-4是Treg和免疫失能T细胞的组成性表达分子[6，10]，提示CTLA-4在HCV 1b基因型可能也参与上调Cbl-b的表达，进而诱导T细胞低反应性。因此，HCV感染可能通过上调CTLA-4的表达，进一步调节Cbl-b的表达水平，诱导机体免疫耐受，Cbl-b和CTLA-4可能在HCV感染慢性化中发挥重要作用。

[1]Huang F，Gu H.Negative regulation of lymphocyte development and function by the Cbl family of proteins.Immunol Rev，2008，224:229-238.

[2]Bachmaier K，Krawczyk C，Kozieradzki I，et al. Negative regulation of lymphocyte activation and autoimmunity by the molecular adaptor Cbl-b.Nature，2000，403（6766）:211-216.

[3]Gomez-martin D，Diaz-zamudio M， Alcocer-varela J.Ubiquitination system and autoimmunity:the bridge towards the modulation of the immune response.Autoimmun Rev，2008，7（4）:284-290.

[4]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案. 中华肝脏病杂志，2000，8（6）:324-329.

[5]Liu YC.Ubiquitin ligases and the immune response.Annu Rev Immunol，2004，22:81-127.

[6]Krawczyk CM，Jones RG，Atfield A，et al.Differential control of CD28-regulated in vivo immunity by the E3 ligase Cbl-b.J Immunol，2005，174（3）:1472-1478.

[7]Loeser S，Penninger JM.Regulation of peripheral T cell tolerance by the E3 ubiquitin ligase Cbl-b.Semin Immunol，2007，19（3）:206-214.

[8]Macian F.NFAT proteins:key regulators of T-cell development and function.Nat Rev Immunol，2005，5（6）:472-484.

[9]Leng Q，Borkow G，Bentwich Z.Attenuated signaling associated with immune activation in HIV-1-infected individuals.Biochem Biophys Res Commun，2002，298（4）:464-467.

[10]Babu S，Blauvelt CP，Kumaraswami V，et al. Regulatory networks induced by live parasites impair both Th1 and Th2 pathways in patent lymphatic filariasis:implications for parasite persistence.J Immunol，2006，176（5）:3248-3256.