中药肝复康对肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的干预作用

张 坤 姜妙娜 张彩华 贾玉杰

肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的活化是肝纤维化的中心环节[1]，对HSCs的活化进行干预是临床治疗肝纤维化的发展方向[2]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是近年来发现的一种进化上保守的蛋白激酶，参与多种病理和生理过程，与细胞的生长、分化、增殖、迁移等过程密切相关[3]。研究表明，在实验性大鼠肝纤维化模型中应用mTOR抑制剂，可降低肝纤维化程度[4]，说明mTOR在肝纤维化的发生发展中发挥一定的作用。核糖体S6激酶（P70S6K）是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，从而控制含5'-TOP结构的mRNA的翻译[5]。研究表明，P70S6K参与了HSC表达胶原的调控，因而与肝纤维化的发生关系密切[6]。但到目前为止，国内外有关mTOR/P70S6K信号通路与肝纤维化发生关系的研究甚少。

关于中药在分子水平包括信号转导等方面的研究还很少。实验证明肝复康对肝纤维化具有预防及治疗作用[7～10]。我们通过体外培养大鼠肝星状细胞-T6（Hepatic stellate cell-T6，HSC-T6），以肝复康进行干预，进一步探讨其抗肝纤维化的作用机制。

材料与方法

一、细胞培养 HSC-T6细胞株由上海中医药大学许列明教授惠赠。细胞复苏后接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的高糖DMEM培养基中，37℃，5%CO2孵箱中培养。

二、含药血清的制备[11]健康SD大鼠，雌雄不限，体重300～350g，被随机分为正常对照组和肝复康治疗组，每组10只，分别给予生理盐水、肝复康（4.16ml/只）灌胃，每天一次，共七天。最后一次灌胃前禁食12小时并在灌胃后一小时腹腔注射苯巴比妥钠麻醉，经腹主动脉采血，4℃、3000rpm离心20分钟，取血清，过滤，56℃灭活30分钟后分装，-80℃保存。

三、HSCs实验 将传代培养的HSC-T6细胞分为三组：正常对照组：在含10%正常对照组血清的DMEM细胞培养基培养48小时；乙醛刺激组：在含10%正常对照组血清的DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L），培养48小时；肝复康治疗组：在含10%肝复康药物血清的DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L），培养48小时。

四、大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K mRNA检测 采用RT-PCR法。使用TRIzol（Invitrogen公司）提取细胞总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定RNA的质量和浓度，在A260/A280为1.18～2.10。使用逆转录反应试剂盒（TAKARA公司）将RNA逆转录成cDNA后进行扩增反应。PCR反应参数为：94℃预变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35 个循环；72℃延伸 7 min。Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K、β-actin引物序列均采用primer5软件自行设计，其引物序列（TAKARA）及扩增产物大小分别为：Ⅰ型胶原：上游：5’-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3’，下游：5’-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3’，产物462bp。Ⅲ型胶原：上游：5’-AGATCATGTCTTGACTCAAGTC-3’， 下 游 ：5’-TTTACATTGCCATTGGCCTGA-3’，产物 463bp。mTOR:上游：5’-CGGGATACTCACGATGGA-3’，下游：5’-GTCAAGTTGCCGAGATGG-3’，产物 447bp。P70S6K：上游 ：5’-TTTTGGCTCGGAAGGTGG-3’， 下 游 ：5’-TGTCGGATTGGAAGTGGC-3’，产物 421bp。β-actin：上游：5’-GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3’，下游：5’-TGATCTT CATGGTGCTAGGAGCC-3’，产物 847bp。将PCR反应产物分别在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统对DNA条带进行吸光度扫描，与相应β-actin的比值分别为Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6KmRNA的相对表达水平。实验重复3次以上，取均值。

五、统计学分析 采用SPSS13.0完成统计学处理，所有数据均用表示，多组比较采用ANOVA法，两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性意义。

结果

一、三组HSC-T6细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达 正常对照组有Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，但程度较弱；乙醛刺激组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达量明显增加，与正常对照组相比有显著性差异（分别为P＜0.01和P＜0.05）；肝复康治疗组Ⅰ型胶原mRNA的表达量较乙醛刺激组表达量明显下降，有显著性差异（P＜0.01），与正常对照组比，表达量增多，有显著性差异（P＜0.01），肝复康治疗组Ⅲ型胶原mRNA的表达量与正常对照组和乙醛刺激组相比无显著性差异（P＞0.05，图 1）。

图1 各组肝星状细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、mTOR和P70S6K的表达 泳道1、2和3分别为正常对照组、乙醛刺激组和肝复康治疗组

二、三组HSCs mTOR、P70S6K mRNA的表达 正常对照组有少量mTOR、P70S6K mRNA的表达；乙醛刺激组mTOR、P70S6K mRNA的表达明显上调，与正常对照组相比均有显著性差异（P＜0.01）；肝复康治疗组mTOR、P70S6K mRNA的表达量比乙醛刺激组明显下调，均有显著性差异（P＜0.01），同时与正常对照组相比，表达量增多，有显著性差异（P＜0.01，图1）。

讨论

乙醛刺激HSCs 是酒精性肝病的主要原因，HSCs在乙醛的刺激下表现为细胞增殖、Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质合成增加，乙醛作为HSCs的激活剂被广泛应用于实验中[12]。在本实验，乙醛刺激组HSCs表达Ⅰ、Ⅲ型胶原增加，说明HSCs被乙醛激活。

HSCs的活化过程是多条信号通路及一系列细胞信号分子网络共同参与作用的结果。TOR是一种丝/苏氨酸（Ser/Thr）激酶，首先在酵母中发现，随后在哺乳动物中也发现了酵母TOR的同源物，称为mTOR。mTOR在稳定状态下存在于胞浆内，激活后进入胞核调控下游靶分子4E-BP1和P70S6K。mTOR可以整合细胞内外的生长因子和环境压力等激发的信号刺激，从而调控细胞生长、增殖和细胞周期[13]。P70S6K是一种核糖体蛋白激酶，在细胞外信号转导通路中广泛表达和激活，其活性受mTOR、MAPK等多种信号调节，活化后能够磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白，S6蛋白可促进5’TOPmRNA的翻译，影响细胞的生长和增殖[14]。5’TOPmRNA可翻译合成核糖体蛋白、延伸因子eEFlα和eEF2以及mRNA稳定蛋白PABP等[15]。本实验中乙醛刺激组mTOR和P70S6K表达量均明显升高（P＜0.01），说明在肝纤维化时mTOR/P70S6K信号通路起到一定的作用。

中药具有多组分、多途径与多靶点的作用特点，针对纤维化等复杂疾病可发挥综合作用。肝复康是以丹参、黄芪、赤芍、白芍、柴胡为主要成份的复方中药，具有活血化瘀、软坚消症的功效。本研究显示，肝复康治疗组HSCs mTOR和P70S6K表达量较乙醛刺激组明显下调，说明肝复康发挥抗纤维化的治疗作用与抑制mTOR/P70S6K信号转导有关。因此，我们认为mTOR/P70S6K信号通路在HSCs活化、肝纤维化形成过程中起到重要作用。

[1]Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol，2008，214（2）:199-210.

[2]Gressner AM，Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.J Cell Mol Med，2006，10（1）:76-99.

[3]Zheng Y，Collins SL，Lutz MA，et al.A role for mammalian target of rapamycin in regulating T cell activation versus anergy.J Immunol，2007，178:2163-2170.

[4]Patsenker E.Potent antifibrotic activity of mTOR inhibitors sirolimus and everolimus but not of cyclosporine A and tacrolimus in experimental liver fibrosis.J Hepatol，2011，doi:10.1016/j.jhep.2010.10.044.

[5]彭贵主，吴波，单人锋，等.mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌中的表达及临床意义.世界华人消化杂志，2008，16（29）:3279-3282.

[6]杨妙芳，许小兵，吴文娟，等.核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控. 第四军医大学学报，2008，29（19）:1753-1756.

[7]车颖，徐婷婷，姜妙娜，等.肝复康胶囊对实验性肝纤维化大鼠肝细胞的保护作用. 中药材，2004，27（6）:428-429.

[8]车颖，徐婷婷，姜妙娜，等.肝复康抗大鼠肝纤维化的实验研究.中国中药杂志，2004，29（6）:599-600.

[9]Xu TT，Jiang MN，Li C.Effect of Chinese traditional compound，Gan-fu-kang，on CCl4-induced liver fibrosis in rats and its probable molecular mechanisms.Hepatol Res，2007，37:221-229.

[10]Lou JL，Jiang MN，Li C，et al.Herb medicine Gan-fu-kang attenuates liver injury in a rat fibrotic model.J Ethnopharmacol，2010，128:131-138.

[11]张彩华，崔晓栋，姜妙娜，等.肝复康不同浓度含药血清对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及细胞基质的影响.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（33）:6496-6499.

[12]Sonoyama T，Tamura N，Miyashita K，et al.Inhibition of hepatic damage and liver fibrosis by brain natriuretic peptide.FEBS Lett，2009，583（12）:2067-2070.

[13]Rao RD，Buekner JC，Sarkaria JN.Mammalian target of rapamyein（mTOR） inhibitors as anticancer agents.Curr Caneer Drug Targets，2004:4:621-635.

[14]Buck M，Chojkier M A.Ribosomal S-6 Kinase-mediated signal to C/EBP-b is critical for the development of liver fibrosis.PLoS ONE，2007，2（12）:e1372.

[15]Jamison JT，Kayali F，Rudolph J，et al.Persistent redistribution of poly-adenylated mRNAs correlates with translation arrest and cell death following global brain ischemia and reperfusion.Neuroseience，2008，154:504-520.