脂多糖在慢性乙型肝炎肝内血管病变中的作用

王 莉 李家斌 马 勇 陆笼辉 代雪枫 丁体龙

肝内血管病变在慢性乙型肝炎的进程中发挥着重要的作用[1]，但其作用机制仍需深入探讨。临床上各种急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化与肝癌患者存在程度不等的肠源性内毒素血症（IETM）[2]，可引起反复与持续的肝细胞损伤和相伴随的炎症细胞浸润，引起一些致纤维化因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）与氧自由基激活和肝脏微循环紊乱而导致肝纤维化[3]。但目前内毒素的发生与慢性乙型肝炎肝内血管病变方面的研究不多。本实验主要通过检测慢性乙型肝炎患者血清中内毒素主要成分脂多糖（LPS）水平及观察肝组织Toll样受体4（TLR4）表达，以探讨LPS在慢性乙型肝炎肝内血管病变中的作用。

材料与方法

一、研究对象 120例患者为解放军第123医院肝病中心2010年4月～2011年6月行肝脏活组织检查的慢性乙型肝炎住院患者（男性86例，女性34例，平均年龄34岁），诊断符合2010年中华医学会感染病学分会肝病学分会联合制订的慢性乙型肝炎防治指南的标准。排除重叠感染HAV、HCV、HDV、HEV者；排除合并脂肪肝、糖尿病、心血管疾病及免疫系统疾病者；排除肝癌者；排除合并呼吸道、泌尿道和消化道感染、自发性腹膜炎等。肝内血管病变级别判断标准参见严家春等[4]报告的方法（表1），经病理科医师阅片，将120例患者分为肝内血管病变1级组46例、肝内血管病变2级组38例和肝内血管病变3级组36例。另取10例肝组织病理学检查大致正常者为对照组。

表1 肝内血管病变评级标准

二、标本采集 （1）外周血标本：所有研究对象空腹8h以上，清晨采3ml肘静脉血，3000r/min离心30min，分离血清，冻存于 -20℃备检；（2）肝组织标本：在B超定位下采用16G肝活检针抽取2条肝组织，其长度均≥1.5cm。标本均经10%甲醛固定、常规石蜡包埋，连续切片，苏木素/伊红染色。

三、血清LPS检测 采用酶联免疫吸附试验法测定，试剂盒购自上海科兴生物科技有限公司，严格按说明书操作。

四、肝组织TLR4表达检测 采用柠檬酸高温高压下进行抗原修复，兔抗人、大鼠和小鼠TLR4多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司（1:200）。采用SABC法进行免疫组化染色（SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司），DAB显色，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行。空白对照以PBS替代一抗。显微镜下观察免疫组化染色结果，采用综合评分法[5]（由研究者及1名病理医师分别阅片和评分）。阳性着色呈棕色细颗粒状。凡细胞质或细胞核不着色为0分，浅棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分；在高倍镜下随机计数5个视野，计算阳性细胞所占百分比，阳性细胞占所有细胞的比例：≤10%为0分，1l%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。将上述2项计分的乘积作为标本的最后得分：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

五、统计学处理 应用SPSS 17.0版统计软件进行统计学处理。计量资料以表示，多组计量资料间比较采用单因素方差分析。两组等级资料之间的比较采用秩和检验，多组等级资料间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用Spearman和Kendall's tau-b相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性意义。

结果

一、不同肝内血管病变级别的慢性乙型肝炎患者血清LPS水平比较 单因素方差分析显示肝内血管病变1级组血清LPS水平与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；肝内血管病变2级组和3级组血清LPS水平与对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）。血清LPS水平依次为肝内血管病变3级＞2级＞1级，提示慢性乙型肝炎肝内血管病变越重，血清LPS升高越明显。Spearman相关分析显示血清LPS水平与肝内血管病变程度呈正相关（r=0.892，P＜0.01，表2）。

表2 各组血清LPS水平（）比较

表2 各组血清LPS水平（）比较

与对照组比较，①P=0.993；与肝内血管病变1级组比较，②P＜0.01；与肝内血管病变2级组比较，③P＜0.01

例数 LPS（ng/ml）对照组 10 0.30±0.13肝内血管病变1级 46 0.32±0.14①肝内血管病变2级 38 0.71±0.14②肝内血管病变3级 36 1.10±0.15③

二、不同肝内血管病变级别的慢性乙型肝炎患者肝组织TLR4表达的比较 见表3。TLR4在对照组肝组织基本无表达（图1）。肝内血管病变1级组TLR4阳性表达与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。肝内血管病变2级组、3级组TLR4阳性表达与对照组比较则有显著性差异（P＜0.01）。TLR4阳性表达在不同肝内血管病变级别组组间比较有显著性差异（x2=92.7，P＜0.01）。TLR4在肝组织内大部分呈弥漫性表达，以肝细胞表达为主（图2），部分血管内皮细胞（图3）、Kupffer细胞、淋巴细胞和胆管上皮细胞也有表达。汇管区基本无表达，在坏死区域的肝细胞浆内TLR4阳性表达明显增强（图4）。TLR4主要表达在胞膜上及部分胞浆内，细胞核无表达。Kendall's tau-b等级相关分析提示：肝组织TLR4阳性表达与肝内血管病变分级呈正相关（r=0.728，P＜0.01）。

表3 慢性乙型肝炎患者肝组织TLR4的表达

图1 对照组肝组织阴性表达（SABC，×100）

图2 TLR4在肝内血管病变3级肝组织胞膜及胞浆阳性表达（SABC，×100）

三、血清LPS水平与肝组织TLR4阳性表达的相关性 Spearman相关分析显示血清LPS水平与肝组织TLR4阳性表达呈正相关（r=0.895，P＜0.01）。

讨论

内毒素血症在慢性肝病时较常见[6]。以往关于内毒素血症在慢性肝病炎症、纤维化方面研究较多，但内毒素在慢性乙型肝炎肝内血管病变中的作用研究较少。

本实验结果显示，除肝内血管病变1级组以外，肝内血管病变2级组和3级组血清LPS水平与对照组相比均有显著性差异（P＜0.01），且血清LPS水平依次为慢性乙型肝炎肝内血管病变3级＞2级＞1级，从而进一步证实慢性乙型肝炎患者存在不同程度的内毒素血症，尤以肝内血管病变3级慢性乙型肝炎最严重。

慢性乙型肝炎患者内毒素血症的原因可能为：（1）慢性肝炎时由于肝坏死、细胞崩解碎片以及循环免疫复合物（CIC）等使肝巨噬细胞（即Kupffer细胞）功能遭到封闭，同时又由于血清纤维连接蛋白的缺乏，Kupffer细胞吞噬功能受到抑制，从而导致肠源性内毒素血症的发生[7]。（2）研究还发现[8]慢性肝炎肝内血管炎症、增生与肝组织病理学呈正相关，有可能互为因果关系。因此肝内血管病变较重时肝组织病理学改变亦较严重，甚至已到达肝硬化。肝硬化患者肠腔内微生态环境遭到破坏，肠道菌群严重紊乱，肠蠕动减慢、延迟、微绒毛损害降低了肠道清除内毒素的能力；此外，内毒素主要经肝脏解毒，而肝硬化肝功能受损、门体循环短路和/或内毒素经腹腔淋巴系统由胸导管进入体循环，逃逸肝脏中的Kupffer细胞对它的吞噬与清除[9]。（3）肝硬化时外周血中内毒素灭活功能减弱，且患者内毒素结合能力显著下降，进而导致内毒素对患者的毒性作用增加[10]。

TLR4是LPS的受体或信号转导分子，在介导LPS的信号转导中具有重要作用[11]。机体多种细胞如单核细胞、浆细胞、中性粒细胞和内皮细胞等细胞表面均能表达TLR4[12]。体外研究[13]发现LPS能明显上调内皮细胞TLR4表达，并呈一定的剂量依赖性。

本实验结果显示，慢性乙型肝炎肝组织TLR4表达与血清LPS水平呈正相关，血清高LPS水平患者肝组织TLR4表达更强，故认为LPS主要是通过上调TLR4参与了慢性乙型病毒性肝炎发病过程的免疫反应、肝细胞及肝内血管损伤，与以往的急性肝损伤研究[14]一致。本实验结果还显示，TLR4在正常肝组织中基本不表达或仅有轻度表达，在肝内血管病变1、2、3级慢性乙型肝炎肝组织TLR4的阳性表达明显增加，而且TLR4阳性表达与肝内血管病变级别呈正相关，提示TLR4在慢性乙型肝炎肝内血管病变中发挥着重要作用。TLR4除表达于肝细胞及血管内皮细胞外，还可表达于Kupffer细胞，提示LPS不仅可以直接损伤肝细胞、血管内皮细胞，还能激活Kupffer细胞而损伤肝组织。

LPS损伤肝内血管内皮的机制可能为：LPS直接作用于血管内皮细胞可迅速引起细胞骨架蛋白的解聚和重组，细胞与细胞间和细胞与基底膜间的粘附连接松解，细胞间缝隙形成，微血管通透性升高，血浆外渗和血流淤滞[15]。内毒素损伤血管内皮后还可促进血液凝固，导致肝微循环障碍而致肝组织缺血、缺氧，肝组织缺血、缺氧又引发大量氧自由基的形成，造成肝组织的脂质过氧化损伤，如此导致恶性循环，不断加重肝损伤[16]。LPS还可激活单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，通过一系列细胞内信号转导系统诱导库普弗细胞释放多种细胞因子和炎症介质，如TNF-α、NO、脂质介质、自由基、内皮素等，其中TNF-α发挥着关键与核心作用，是其他细胞激活的始动因子，可与LPS共同作用于肝脏血管内皮细胞、肝星状细胞[17]。

综上所述，LPS及其受体在慢性乙型肝炎肝内血管病变中起着重要的作用，血清LPS水平可作为判断肝内血管病变程度的指标之一。深入探讨内毒素损伤肝内血管内皮细胞的机制，研究调节或干扰TLR4信号途径以保护和修复内皮细胞功能，对于改善慢性乙型肝炎的预后有着积极的意义。

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