基因导入途径与脑内表达的关系研究

赵浩 李运军 陈立华 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

基因导入途径与脑内表达的关系研究

赵浩 李运军 陈立华 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

目的比较不同途径(股静脉、颈内动脉、侧脑室及鞘内)导入转铁蛋白靶向脂质体介导的LacZ基因(transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes，Tf-PLs)在大鼠脑内的表达，寻找出适合临床的安全有效的基因导入方法。方法120只雄性SD大鼠随机分为静脉导入组、动脉导入组、侧脑室导入组、鞘内注射组和治疗组，其中治疗组分别将Tf-LacZ通过股静脉、颈内动脉、侧脑室立体定向及鞘内的方式注射入大鼠体内。术后24和48h分别取脑(每项检测指标每组随机选取8只大鼠)，光学显微镜下观察LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶(beta-gal)的表达，Real time-PCR比较不同组别LacZ mRNA的表达，试剂盒检测β-半乳糖苷酶的活性。结果免疫组化提示动脉导入组及静脉导入组可以实现β-半乳糖苷酶在脑内的广泛性表达，并且动脉导入组LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表达高于静脉组(P＜0．05)。侧脑室及鞘内注射组只能实现β-半乳糖苷酶的局限性表达，且LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表达要低于动脉及静脉导入组(P＜0．05)。结论动脉导入将外源基因转入大鼠脑内的效果最好，静脉导入的效果优于侧脑室注射和鞘内注射的方式。在可行性方面，经过静脉导入途径是较为方便、易行、有效。

脂质体转铁蛋白血脑屏障转运途径

血脑屏障(BBB)是一层将脑组织和血液系统分隔开的物理屏障，其基本结构成分是单层脑毛细血管内皮细胞及其相互间的紧密连接。在正常生理情况下只允许分子质量＜600Da的脂溶性低分子通过，这一特性对于维持大脑内环境的相对稳定十分重要，但同时也使超过95%以上的治疗药物，尤其是最近发展很快的高分子生物药物如神经营养因子、多聚寡核苷酸、抗体等无法通过血脑屏障到达脑部发挥作用，成为中枢神经系统疾病治疗的瓶颈。因此跨血脑屏障的药物转运研究成为当前脑类疾病治疗的重点。在我们本项研究中，我们选取了可以与血脑屏障表达的转铁蛋白受体相结合的转铁蛋白靶向脂质体，将其包裹外源基因LacZ后，通过4种不同的方式注射至大鼠体内，通过比较外源基因在大鼠脑内的表达情况，筛选出一种较为方便、快捷、有效的外源基因导入方法。

材料与方法

1．试剂:pCMV-LacZ质粒由本实验室保存，GFAP-LacZ质粒由上海吉凯基因公司合成;胆固醇氯甲酸酯(购自上海晶纯试剂有限公司);N，N-二甲基乙二胺(购自日照力德士化工有限公司)、转铁蛋白(Transferin，Tf，购自Sigma公司)、2-亚氨氢氯化硫醇Traut's试剂盒(购自PIERCE公司);DSPEPEG-MAL、POPC、DSPE-PEG2000、DSPE(购自Creative PEGWorks);PicoGreen核酸定量试剂盒、NanoOrange蛋白定量试剂盒(购自Invitrogen公司);琼脂糖Sepharose CL-4B、葡聚糖Sephadex G-25(购自北京/东凯生物);质粒大提试剂盒Maxiprep(购自Qiagen，Chatworth，CA);LacZ Dectction Kit for Tissues(购自Invivogen公司)，RNeasy Mini试剂盒和Beta-Glo Assay System试剂盒(购自Promega公司)，BCA蛋白检测试剂盒(Piece公司)。

2．仪器:烧瓶、夹热套、搅拌器、Cary Eclipse荧光分光光度计、SENCO旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)、LGJO．5冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)、KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、VORTEX-5旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，ABI7900HT定量PCR仪等。

3．实验动物:200～250g SPF级SD雄性大鼠120只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。无菌手术在北京协和医学动物实验中心屏障动物实验设施进行［SYXK(京)2005-0008］，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。将Tf-PLs分别通过股静脉、颈内动脉、侧脑室立体定向、鞘内注射4种方式注射入大鼠体内，并设立对照组作为参照。

4．转铁蛋白靶向脂质体的制备:pGFAP启动子启动的LacZ表达质粒pGFAP-LacZ质粒的构建与提纯送上海吉凯基因化学技术有限公司合成构建。将33mmol/L的DC-胆固醇、33mmol/L的POPC(25．971mg/ml)、1．65mmol/L的DSPE -PEG2000(5．61mg/ml)、0．33mmol/L的DSPE-PEG-MAL (1．122mg/ml)各385μl混合后，室温旋转蒸干溶剂，加入4ml二氯甲烷复溶后加入1ml(200μg/ml)质粒水溶液，涡旋振荡5min，超声5min，30℃旋转蒸干氯仿，得到包裹pGFAP-LacZ质粒的脂质体。利用Traut's试剂盒，将Tf的氨基末端活化，连接至脂质体的聚乙二醇长链末端，构建Tf-PLs。

5．组织化学染色:每组8只动物分别于药物注射后48h处死，用0．01mol/L的PBS和4%多聚甲醛以先快后慢的速度行心脏灌注。取脑置于4%多聚甲醛中固定过夜，再分次浸泡于10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水至组织沉底。OCT胶包埋组织于恒冷冷冻切片机切片，切片厚度为12μm，每2张切片间隔70μm，铺片于DEPC处理过的载玻片。将X-gal染色液滴加到切片上，孵箱中37℃孵育2～4h后封片镜检。

6．Real time PCR:药物注射24h后每组8只大鼠过量麻醉处死，断头取脑及周围器官，迅速放入冻存管液氮中保存。提取各组脑组织总RNA并通过RNeasy Mini试剂盒将总RNA反转录为cDNA，设计上下游PCR引物，LacZ基因上游引物为5'-TGGGAGGCTCAAAGCAAGAC-3'，下游引物为5'-TGACGACAAGGGACAGGTGAT-3'，β-肌动蛋白上游引物为5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'，下游引物为5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'。利用ABI7900HT定量PCR仪，进行实时定量PCR实验。SDS 2．2软件对数据进行分析处理，并导出文件及图像。利用管家基因β-肌动蛋白对目的基因的表达进行校正，得到相对定量结果。

7．β-半乳糖苷酶活性测定:药物注射48h后每组处死8只大鼠并断头取脑，将脑组织液氮保存，蛋白裂解液裂解脑组织并且离心后得到脑组织上清液，BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白量。将提取的组织蛋白上清液与Beta-Glo Assay溶液混合，避光室温孵育1h，用荧光计中测定混合液的相对光单位(RLU)。绘制标准曲线并将RLU转换成皮克(pg)，β-半乳糖苷酶的在各个器官中的表达量以皮克/毫克(pg/mg)蛋白的形式表示。

8．统计学方法:应用SPSS 13．0统计软件包进行统计学分析。各组数据均以均数±标准差±s)的方式表示。采用单向方差分析方法中的Bonferroni法进行各组均数的多重比较。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

1．转铁蛋白靶向脂质体(Tf-PLs)的特性:合成的脂质体通过光散射的方法测定平均粒径为100nm，计算得到的脂质体包封率为70．23%～86．24%，平均78．23%。Tf偶联率平均为69%。脂质体的Zeta电位为30．2mV。

2．组织化学染色:动脉导入组及静脉导入组可以实现β-半乳糖苷酶在脑内的广泛性表达，动脉导入组的表达强于静脉导入组，侧脑室及鞘内注射组只能实现脑内的局部表达(图1)。

图1 LacZ基因表达产物在大鼠脑内的组织化学染色

3．Real time PCR:药物注射24h后，动脉导入组LacZ基因mRNA相对量(22．391×10-6)高于静脉导入组(19．182×10-6，P＜0．05)、侧脑室(9．4263× 10-6，P＜0．05)及鞘内注射组(8．732×10-6，P＜0．05)，静脉导入组与侧脑室及鞘内注射组相比具有统计学差异(P＜0．05)。侧脑室组与鞘内注射组比较无统计学差异(图2)。

图2 LacZ基因在大鼠脑内mRNA的表达

4．β-半乳糖苷酶活性:药物注射48h后，动脉导入组β-半乳糖苷酶活性为0．91pg/mg，静脉导入组为0．60pg/mg，侧脑室为0．52pg/mg及鞘内注射组为0．49pg/mg。动脉导入组与静脉导入组、侧脑室及鞘内注射组相比，具有显著性差异(P＜0．05)。静脉导入组与侧脑室组及鞘内注射组相比具有统计学差异(P＜0．05)。侧脑室组与鞘内注射组比较无统计学差异(图3)。

图3 LacZ基因在大鼠脑内的表达

讨论

由于血脑屏障的存在，因此我们将LacZ基因包裹于转铁蛋白靶向脂质体内通过股静脉、颈内动脉、侧脑室及鞘内的方式，注射至大鼠体内，观察LacZ基因在大鼠脑内的表达，从而寻找一种方便、快捷，但又能够实现脑内高效表达的一种给药途径。有文献报道，在血脑屏障的血管内皮表面可以表达转铁蛋白的受体，偶联有转铁蛋白的脂质体可以携带外源基因，依靠配体、受体相结合的靶向作用，激发血管内皮的转运途径，使脂质体跨越血脑屏障，进入脑内［1，2］。以往研究表明，在转铁蛋白靶向脂质体的协助下通过静脉途径可以将外源基因转运至脑内，实现其在脑内的广泛性表达。在我们的研究中也发现，将LacZ基因包裹至转铁蛋白靶向脂质体内，通过静脉注射的方式可以实现LacZ在脑内的广泛性表达［3～5］。但是，也有文献报道，通过侧脑室注射的方式，可以更好地实现外源基因在脑内的表达。因此我们在本实验中将转铁蛋白靶向脂质体通过静脉、动脉、侧脑室及鞘内4种方式，注射至大鼠体内，通过组织化学染色、目标基因mRNA检测以及目标基因蛋白产物的表达，比较4种注射途径在转导外源基因应用过程中的优缺点［6，7］。

在组织化学染色中，我们发现动脉导入组可以更好地实现LacZ基因在颅内的广泛性表达，且表达强度要高于静脉导入组。静脉导入组虽然也可以实现颅内的广泛性表达，但是其表达强度要低于动脉导入组，考虑原因是通过静脉注射后，脂质体要经过全身的血液循环，从而会导致部分脂质体的损失。虽然我们合成的脂质体能够在血液中维持一定的稳态，避免吞噬细胞将其作为外来异物清除掉，但是有文献报道，脂质体仍然会在脾脏、肺脏中进行沉积，从而导致脂质体的损失，影响其携带外源基因进入脑内的表达［8～13］。侧脑室注射组和鞘内注射组只能实现脑室局部的局限性表达，在远离脑室的部位很难发现LacZ基因的表达，因此这两种方法在动物实验，特别是大鼠缺血性脑卒中的实验中，由于脑梗死后缺血半暗带分布的广泛性，治疗基因只是在局部表达，很难实现满意的治疗效果。因此，动脉和静脉导入方法使外源基因在空间分布上的优越性，使这两种方式成为比较好的外源基因导入途径。

在LacZ基因mRNA检测及表达产物β-半乳糖苷酶活性测定的实验中，我们同样发现通过动脉及静脉途径导入的方法，与侧脑室及鞘内注射的方法比较，可以更高效地表达目的基因。但是，在我们的实验中，由于我们提取的是大鼠全部脑组织，在此基础上对LacZ基因的mRNA及β-半乳糖苷酶活性进行测定，因此掩盖了侧脑室及鞘内注射途径在局部部位的高表达的优势，即其在数量上的优势。因此我们认为，根据不同动物模型的需要，如果是治疗广泛性病变，采用动脉途径或静脉途径可以实现较好的空间分布性，如果治疗的病变较为局限，可以采纳侧脑室或鞘内注射的方式。

此外，动脉途径和静脉途径比较，由于动脉途径需要暴露大鼠的颈总动脉系统，对于实验动物的创伤较大，而且对实验人员的显微解剖和手术技巧要求较高。而静脉途径只需要暴露大鼠股静脉，甚至技术熟练的实验人员可以通过尾静脉注射的方式给药，从而节约大量的时间，提高了实验效率。侧脑室注射需要涉及到立体定向装置和专门的穿刺针，对于手术技术的要求更高。因此，在满足实验要求的前提下，采取静脉导入外源基因是一种比较便捷、高效的注射途径。

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(收稿:2012-06-29)

(修回:2012-07-08)

Correlations Between Gene Transfer Approaches and Intracerebral Gene Expression．

Zhao Hao，Li Yunjun，Chen Lihua，Wei Qun，Dai Yiwu，Xu Ruxiang，Wang Renzhi．Bayi Brain Hospital Affilated With The Military General Hospital of Beijing PLA，Beijing 100700，China

ObjectiveTo compare intracerebral expression of transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes(Tf-PLs)transferred by different approaches via the femoral vein，internal carotid artery(ICA)，lateral ventricle(LV)and intrathecal routes in rats，in an attempt to seek a safe and effective approach for gene transfer appropriate for clinical use．MethodsMale SD rats were randomized in to four groups and Tf-LacZ was injected into the rats via the femoral vein，ICA，LV and intrathecal routes，respectively．Eight animals from each group were sacrificed and the brains were removed 24 and 48 h after Tf-LacZ injection．The expression of LacZ encoded βgalactosidase(β-gal)was observed under an optical microscope．LacZ mRNA expressions in different groups at the designated time points were detected by RT-PCR，and the expressions of β-gal were detected by Reagent kit．The results obtained were compared．ResultsExtensive expression of β-gal was achieved in the femoral vein and ICA groups，and the expression of LacZ mRNA in the CA group was significantly high than that in the femoral vein group(P＜0．05)．Only local expression was achieved in the LV and intrathecal groups，and the expressions of LacZ mRNA and β-gal activity in these two groups were significantly lower than those in the femoral vein and ICA groups(P＜0．05)．ConclusionThe effect of transferring exogenous gene into the rat brain was the best in the arterial injection group，and the effect in the venous injection group was better than that in the LV and intrathecal injection groups．The venous transfer route is easier，more convenient and more effective than the other routes in terms of practical feasibility．

Lipiosomes;Transferrin;Blood brain barrier;Transfer approach

国家自然科学基金资助项目(81100917)

100700北京军区总医院附属八一脑科医院(赵浩、李运军、陈立华、魏群、戴宜武、徐如祥);100730中国医学科学院北京协和医院(王任直)

徐如祥，电子信箱:zjxuruxiang@163．com