hexarelin的细胞保护作用研究

丁帆 程秀丽 郝维 高雪 曹济民

hexarelin的细胞保护作用研究

丁帆 程秀丽 郝维 高雪 曹济民

目的研究生长素释放肽hexarelin是否具有细胞保护作用。方法利用H2O2作用于RAW264．7巨噬细胞作为细胞氧化应激性损伤模型，以细胞活性(MTT法检测)、热休克蛋白70(HSP70)表达水平(Western blotting法检测)等指标判断细胞损伤及修复情况，观察不同浓度hexarelin预处理不同时间对上述细胞氧化应激性损伤的保护作用。结果与对照组相比，H2O2造成了明显的细胞氧化应激性损伤，细胞活性明显下降，HSP70蛋白表达水平似有升高，但与对照组相比无统计学差异; hexarelin预处理可剂量依赖性地减轻由H2O2所致的细胞活性下降，且这种作用在hexarelin 10－5mol/L、预处理2h对细胞的保护作用最强。单独用hexarelin预处理细胞后，HSP70的表达即明显升高。给予hexarelin预处理，再用H2O2刺激细胞，HSP70的水平进一步升高。结论Hexarelin具有抗氧化应激和细胞保护作用，这种作用与其诱导HSP70的表达有关。

生长素释放肽细胞保护氧化应激

细胞在受到伤害性刺激后会发生一系列基因表达和代谢的变化。在众多错综复杂的变化中，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表达和功能变化对于细胞抵抗损伤发挥着至关重要的作用。HSP是广泛存在于生物体内的细胞应激蛋白，也是非常重要的分子伴侣［7］。当机体或细胞受到高温、缺氧、重金属、氧自由基等伤害性刺激时，HSP即大量表达。HSP70是HSP家族中最为保守、作用最显著的成员，它可以帮助蛋白质正确折叠。在应激状态下，可抑制细胞氧化损伤，使细胞凋亡减少，包括减轻化疗药物导致的细胞凋亡［8］。HSP70可通过增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常代谢功能，提高细胞的活性发挥其细胞保护作用。因此，在探讨hexarelin的细胞保护作用机制时，本工作重点研究HSP70在其中的角色。

材料与方法

1．材料:RAW264．7巨噬细胞株购自中国医学科学院细胞中心;hexarelin购自Sigma Aldrich公司;DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司;HSP70抗体购自Santa Cruz公司;MTT试剂盒购自Promega公司;RIPA细胞裂解液及BCA法蛋白质浓度测定试剂盒购自碧云天公司。

2．细胞培养:细胞用含10%血清的DMEM基培养，待细胞生长至汇合70%～80%后，换用无血清培养液饥饿培养24h，使细胞同步于静止期，分别加入不同浓度hexarelin (10－8、10－7、10－6和10－5mol/L)，分别预孵育1、2、6、12和24h，收集细胞用于实验。

3．细胞分组:①正常对照组，给予同体积的生理盐水;②H2O2组，给予H2O2(10－4mol/L)刺激3h;③hexarelin+H2O2组:细胞与10－5mol/L hexarelin共培养，然后加入H2O2刺激3h。以上3组分别在1、2、6、12和24h时间收样进行MTT实验。

4．MTT分析:参照文献方法进行操作，每组设6个复孔，分别加入不同浓度(10－8、10－7、10－6、10－5mol/L)的hexarelin预孵育1、2、6、12和24h，再用H2O2(10－4mol/L)刺激24h，之后在酶标仪上570nm处测定吸光度(A值)。

5．Western blotting分析:弃去细胞上清，按照说明书指示用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。检测蛋白浓度后，取同样质量的蛋白样品50μg，进行SDS－PAGE电泳。之后将样品电转至PVDF膜上。随后与相应的一抗及二抗反应，用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用数码成像分析系统软件对电泳条带进行密度扫描，以β－actin为内参照进行定量分析。

5．统计学方法:统计软件为SPSS 13．0，数据以均数±标准差±s)表示，用方差分析(ANOVA)进行统计学处理，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

1．hexarelin单独作用对细胞活力的影响:将不同浓度的hexarelin分别加入到培养液中，用MTT的方法检测RAW264．7细胞的活性。结果显示，hexarelin大体呈剂量依赖性地促进细胞活性，其中hexarelin在10－5mol/L浓度时的细胞保护作用最为明显(P＜0．05)(图1)，其他浓度的hexarelin对细胞活性虽似有增高作用，但没有统计学意义。因此在随后的实验中，均采用hexarelin 10－5mol/L的浓度。

图1 MTT实验显示H2O2和不同浓度hexarelin对RAW264．7细胞活性的作用

2．hexarelin的抗氧化应激损伤作用:用hexarelin预处理RAW264．7细胞不同时间，然后给予H2O2造成细胞氧化应激损伤，观察hexarelin预处理是否可减轻由H2O2造成的细胞活力下降。结果显示，H2O2可使细胞活力明显下降(图2)(与对照组相比，P＜0．05);用hexarelin预处理不同时间(1～24h)均可促进细胞活力的恢复(图2)，说明hexarelin预处理可明显减轻H2O2导致的细胞氧化应激损伤。由于hexarelin作用2～4h后显示出最强的保护作用，故在随后的试验中统一用hexarelin预处理2h。

图2 MTT实验显示hexarelin对H2O2诱导的细胞氧化损伤的保护作用

图3 Western blotting实验显示H2O2和hexarelin对HSP70蛋白表达的作用

3．hexarelin促进氧化应激损伤细胞的HSP70表达:用10－5mol/L hexarelin预处理细胞2h，然后再用H2O2(10－4mol/L)刺激RAW264．7细胞3h，以造成氧化应激损伤，然后用Western blotting法观察细胞的HSP70蛋白表达情况。结果显示，用H2O2处理的细胞其HSP70的蛋白表达似较正常对照组略有升高，但没有统计学意义(图3);10－5mol/L hexarelin单独作用细胞2h其HSP70的蛋白表达水平与正常对照组相比明显升高，hexarelin预处理后再加入H2O2(hexarelin+H2O2)，RAW264．7细胞的HSP70表达进一步升高，提示HSP70在hexarelin的抗细胞氧化损伤中的重要作用。

讨论

氧化应激损伤常见于临床多种疾病及病理过程，如组织缺血/再灌注损伤、败血症休克以及多器官功能衰竭等，其发生的基本机制是活性氧对组织细胞的损伤，表现为线粒体损伤、细胞活性的下降，凋亡率升高等。HSP是细胞在多种理化及生物应激原作用下表达增多的一组蛋白质，其中HSP70是HSP家族中与细胞保护关系最为密切的一族，它能抑制氧化应激损伤和炎症反应，保护蛋白不受损伤，抑制细胞的凋亡。在各种应激或损伤刺激的情况下，对于HSP70如何发挥其细胞保护作用目前尚不明确［9］。就目前研究资料表明HSP70可能从提高细胞对应激原的耐受性、分子伴侣作用和抗细胞凋亡作用几方面发挥细胞保护的作用。还有研究表明，热休克预处理通过诱导多种热休克蛋白的表达干预线粒体信号通路与死亡受体通路而抑制过氧化氢所致的C2C12细胞凋亡［10］。

本实验室近来的研究工作表明，hexarelin可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡及氧化性低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡，这提示hexarelin具有细胞保护作用［4，11］。本工作旨在观察hexarelin是否能通过提高HSP70表达来增加细胞活性，降低活性氧对细胞的损伤，从而发挥细胞保护作用。我们首先观察了hexarelin是否能增加细胞活性，并确定其最适浓度及作用时间。结果显示，hexarelin在10－5mol/L浓度及预处理2～4h时，抗氧化应激损伤和促进细胞活力的作用最为明显。进而我们研究了hexarelin是否能够通过提高HSP70的蛋白表达量来发挥细胞保护作用。Western blotting结果表明，单独给予细胞hexarelin即可增加细胞的HSP70表达水平;给予细胞hexarelin预处理后再给予H2O2，细胞表达HSP70的量大大增加。表明hexarelin的抗氧化应激损伤和细胞保护作用与诱导HSP70表达有密切关系，也提示hexarelin具有细胞保护药物的潜在开发价值。

1Chen C，Wu D，Clarke IJ．Signal transduction systems employed by synthetic GH－releasing peptides in somatotrophs［J］．J Endocrinol，1996，148(3):381－386

2Korbonits M，Grossman AB．Growth hormone－releasing peptide and its analogues Novel stimuli to growth hormone release［J］．Trends Endocrinol Metab，1995，6(2):43－49

3Xu X，Pang J，Cao JM，et al．GH－releasing peptides improve cardiac dysfunction and cachexia and suppress stress－related hormones and cardiomyocyte apoptosis in rats with heart failure［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(4):H1643－1651

4Pang J，Xu RK，Xu X，et al．Hexarelin protects rat cardiomyocytes from angiotensin ii－induced apoptosis in vitro［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(3):H1063－1069

5Xu X，Pang J，Yin H，et al．Hexarelin suppresses cardiac fibroblast proliferation and collagen synthesis in rat［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5):H2952－2958

6Pang J，Xu Q，Xu X，et al．Hexarelin suppresses high lipid diet and vitamin D3－induced atherosclerosis in the rat［J］．Peptides，2010，31(4):630－638

7鲍秀琦，刘耕陶．热休克蛋白:细胞保护和肿瘤治疗的新靶点［J］．药学学报，2008，43(3):234－240

8Samali A，Orrenius S．Heat shock proteins:regulators of stress response and apoptosis［J］．Cell Stress Chaperones，1998，3(4):228－236

9李征宇，赵霞．热休克蛋白对细胞凋亡信号转导途径的调节［J］．中国科学C辑生命科学，2004，34(1):6－13

10肖卫民，蒋碧梅，石永忠．热休克蛋白抑制过氧化氢所致C2C12细胞凋亡的机制［J］．中南大学学报，2004，29(1):6－10

11徐启华，丁帆，代中华，等．Hexarelin对ox－LDL引起的大鼠脑微血管内皮损伤的保护作用［J］．医学研究杂志，2010，39(7):26－29

(收稿:2012－02－28)

(修回:2012－03－19)

Cytoprotection Effect of Hexarelin．

Ding Fan，Cheng Xiuli，Hao Wei，Gao Xue，Cao Jimin．Department of Physiology and Pathophysiology，Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences，School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

ObjectiveTo investigate whether hexarelin could exert antioxidant cytoprotection effects．MethodsUsing H2O2to induce oxidative injury in RAW264．7 macrophage－like cells，we observed if hexarelin pretreatment(with different concentrations and times)could prevent cells against oxidative injury．Cell viability and proliferation were assayed by MTT，and the expression level of heat shock protein 70(HSP70)was evaluated by Western blotting．ResultsCompared with the control cell，H2O2induced significant oxidative injury，as evidenced by a sharp drop in cell viability;the protein expression level of H2O2－challenged cells appeared higher than the control but did not show statistical significance．Pretreatment with hexarelin dose－dependently protected the H2O2－induced decrease in cell viability，and this protection was the most significant when hexarelin was at 10－5mol/L and pretreatment for 2 hours．Hexarelin alone could increase the protein expression of HSP70 in RAW264．7 cells．Hexarelin pretreatment plus H2O2challenging further increased the HSP70 level．ConclusionHexarelin could exert anti－oxidant cytoprotection effect，which is associated with the induction of HSP70 expression．

Hexarelin;Cytoprotection;Oxidative injury

生长激素释放肽(growth hormone releasing peptides，GHRP)是一类人工合成的、含D型氨基酸残基的寡肽(一般为6肽)，hexarelin是其中的一种［1］。GHRP的作用与ghrelin相似，均可通过生长激素促泌素受体(GHSR)刺激脑腺垂体释放生长激素［2］。但随后的研究发现GHRP具有不依赖生长激素分泌的外周器官保护作用，其中我们实验室近年来就GHRP的心血管保护作用开展了系列研究，表明GHRP对心衰、心肌细胞凋亡、心肌纤维化和动脉粥样硬化均有明显抑制作用［3～6］。这些研究强烈提示GHRP具有细胞保护作用，包括可能具有减轻细胞氧化应激性损伤的作用，但目前仍没有直接实验证据支持这一推断。本工作的目的是证明这一推断是否正确。由于GHRP具有分子质量小、口服有效、毒性很低、相对价廉等特点，具有药物开发的潜在前景，因此比ghrelin更有开发价值。本工作以RAW264．7巨噬细胞为模型，探讨hexarelin是否具有抑制由过氧化氢(H2O2)所致的细胞氧化应激性损伤的作用。

国家“973”基金资助项目(2011CB503900)

中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生理学和病理生理学系

曹济民，电子信箱:caojimin@126．com