黄芪对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

宋 岩，刘秀萍，白伟良，季文樾

(中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 110004)

黄芪对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

宋 岩，刘秀萍，白伟良，季文樾

(中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 110004)

［目的］体外观察黄芪对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制。［方法］用20、100、200 μg/mL的黄芪作用于Hep-2细胞24 h，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率，共聚焦荧光显微镜观察细胞凋亡，Western Blot检测Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表达。［结果］黄芪对Hep-2细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性;随着黄芪浓度增高，处于G2/M期细胞的比例逐渐升高，同时伴有G0/G1期细胞减少，细胞凋亡率逐渐升高，各实验组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义(P＜0.05);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western Blot检测显示黄芪可剂量依赖性抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表达。［结论］黄芪可通过抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表达，引起喉癌细胞G2/M期阻滞，抑制增殖和凋亡，发挥抗癌作用。

黄芪;喉癌;凋亡

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈增长趋势。喉癌总的生存率很低，因此，人们一直在不断地寻求有效的治疗方式，其中之一就是寻找新的、高效、低毒的抗肿瘤药物。近年来国内外研究表明，黄芪中黄酮成分黄芪素，通过调节花生四烯酸系统的代谢，诱导肿瘤细胞周期停滞，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，抗肿瘤侵袭和转移，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等机制发挥其抗肿瘤作用。本文探讨不同浓度黄芪对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用，为进一步阐明黄芪的抗喉癌机制及临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

细胞株:喉鳞状细胞癌hep-2细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。试剂:黄芪注射液购自正大青春宝集团，核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)，MTT，碘化丙啶(proidum iodide，PI)，二甲基亚枫(dimethyI，sulfoxide，DMSO)等均购自 Sigma公司;Annexin V凋亡检测试剂盒购自凯基公司;CCK8和OECHST33258，CyclinB1，Bcl-2抗体购于上海生工;TMPI-1640培养液由Gibco生产;标准胎牛血清，胰蛋白酶，青链霉素，磷酸盐缓冲溶液(phophate buffered saline，PBS)购自上海生工生物有限公司。仪器:FACSCalibur型流式细胞仪(美国，Becto Dickinson公司)，CO2恒温培养箱、离心机(日本，SANYO公司)，SW-CJ-1B型净化工作台(苏州净化设备厂)

1.2 细胞培养

喉鳞状细胞癌Hep-2细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO2饱和湿度的条件下培养，至生长到对数期用于下述实验。

1.3 细胞增殖检测

Hep-2细胞在含有10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基常规培养，消化并计数细胞，调整细胞密度5×104/mL，以5×103/孔的密度接种细胞于96孔板，接种后第2天加入不同浓度黄芪(20，100，200 μg/mL)的培养液，对照组加等体积 RPMI 1640，每组3个复孔。分别于药物作用24 h后加入CCK8 试剂10 μL，37℃反应2 h，450 nm 波长检测各孔吸光度值(A)。

按公式计算细胞存活率:存活率=(1-实验组A/对照组A)×100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞仪分析细胞凋亡率

将对数生长期Hep-2细胞按浓度1×107个/瓶接种到细胞培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后，换成含有不同浓度的黄芪(20，100，200 μg/mL)的培养液，继续作用24 h，收集细胞，PBS洗2次，70%冰乙醇4℃下固定，加入RNase溶液，上机前加入PI遮光染色30 min，PBS洗2次，过100目网，调整细胞浓度到1×106个/L，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 荧光显微镜观察凋亡

将预处理过的盖玻片置于6孔板内，Hep-2细胞(5×105/孔)接种过夜，分为正常对照组与给药组，给药组加入200 μg/mL的黄芪培养液培养24 h，PBS洗2次，用吹风机(冷风)吹干玻片，固定液(甲醇与冰乙酸的体积比为3∶1)固定15 min，PBS洗1次，加Hoechst 33258荧光染料(1 mL)，37℃避光孵育20 min，含1%甘油的PBS封片，于荧光显微镜下观察，照相。

1.6 Western Blot分析

将喉癌细胞分 4 组分别加(20，100，200 μg/mL)不同浓度黄芪及培养基作用喉癌Hep-2细胞24 h后，用预冷的PBS洗细胞2次，然后加细胞裂解液冰上放置20 min，12000 r/min，4℃离心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的总蛋白进行12%SDS-PAGE实验，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶500稀释的兔抗人Bcl-2，CyclinB1 单克隆抗体，室温孵育 3 h，TBS 洗涤后加入稀释度1∶4000的二抗，室温孵育90 min;TBS洗涤后经化学发光试剂孵育，发光，显示实验结果。所有实验重复3遍后采用ECL检测系统，应用GENE TOOLS软件分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行分析。所有计量资料均采用±s表示，两组之间均数的比较采用t检验，3组以上样本间关系采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芪对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长的抑制作用

药物作用24 h 后，20 μg/mL、100 μg/mL 与200 μg/mL黄芪组抑制率分别为(35.38±0.17)%、(59.12 ±0.21)%和(84.55 ±0.27)%，各组比较差异均有显著性意义，P＜0.05。

2.2 黄芪对Hep-2细胞周期分布及细胞凋亡的影响

检测结果表明，不同浓度的黄芪分别作用Hep-2细胞24 h后，与对照组比较，S期细胞比例减少，G2/M期细胞比例显著增加，阻滞在G2/M期，且差异均有显著性意义(P＜0.05);随着黄芪浓度的增加，阻滞作用呈增强的趋势，见图1。

图1 不同浓度黄芪作用24 h后细胞各周期分布Fig 1 Flow cytometry analysis cell cycle distribution in different concentrations of Astragalus groups

2.3 黄芪作用Hep-2细胞24 h后形态学变化

Hoechst 33258染色荧光显微镜观察，200 μg/mL黄芪作用于Hep-2细胞24 h细胞形态发生显著性改变，呈现染色质边集，核固缩，核片断化，核碎裂溶解。随着黄芪浓度增加，凋亡的细胞明显增多，甚至出现大片细胞脱落形成细胞脱失区，结果见图2。

2.4 不同浓度黄芪作用后Bcl-2和Cyclin B1表达情况

分别用20，100，200 μg/mL 黄芪处理细胞 24 h后，cyclin B1和Bcl-2后蛋白表达下降，随浓度增加而明显下降，见表1、图3。

图2 Hoechst33258观察黄芪作用Hep-2细胞24 h后形态学变化Fig 2 Observe Hep-2 cell apoptosis with Astragalus treating by Hoechst 33258 staining

表1 不同浓度黄芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表达的变化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

表1 不同浓度黄芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表达的变化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

与对照组比较，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

Bcl-2 Cyclin B1对照组1.15 ±0.08 0.97 ±0.24黄芪 20 μg/mL 组 0.74 ±0.071) 0.64 ±0.122)黄芪 100 μg/mL 组 0.26 ±0.041) 0.43 ±0.191)黄芪 200 μg/mL 组 0.13 ±0.021) 0.15 ±0.031)

图3 不同浓度黄芪作用后Bcl-2和Cyclin B1蛋白表达情况Fig 3 Protein Expression of Bcl-2 and Cyclin B1 with Astragalus treating by Western blot assay

3 讨论

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，是东北地区最常见的头颈部恶性肿瘤，大约占所有新发恶性肿瘤的1%，其中90%以上是喉鳞状细胞癌。目前，在放化疗和外科手术联合治疗的情况下，Tis、T1及T2期喉癌治疗有效率在80%～90%左右，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。尽管外科手术和放化疗技术有了明显进步，但患者的5年生存率仍没有提高，原因是多方面的，其中对发病机制研究不够完善、没有明确的治疗靶点是最关键的。

近年来国内外研究表明，黄芪中黄酮成分黄芪素，通过调节花生四烯酸系统的代谢，诱导肿瘤细胞周期停滞，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，抗肿瘤侵袭和转移，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等机制发挥其抗肿瘤作用。Roy等［1］发现用小剂量黄芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60细胞大量停滞于S或G2/M期，而大剂量黄芪素则诱导细胞凋亡。Chao等［2］研究发现黄芪素可使膀胱癌细胞停滞于G2/M 期。Leung等［3］用50 μmol/L黄芪素培养人非小细胞性肺癌H460细胞24 h后，发现细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase，CDK1)和细胞周期蛋白(cyclin)B1蛋白表达明显降低，导致S期生长停滞，阻止细胞从S期进入G2/M期。本研究发现，黄芪具有抑制喉癌Hep-2细胞生长，促进凋亡的作用。其作用机制可能和黄芪调控Bcl-2，Cyclin B1凋亡相关基因有关。

本研究通过MTT检测发现，黄芪对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的生长具有抑制作用，且呈现明显的浓度依赖性。抑制率曲线随浓度增加而逐渐上升，到200 μg/mL时，表现出强烈的抑瘤效果，由此推断黄芪可以在体内外发挥对喉癌的抑制作用。

通过流式细胞检测不同浓度的黄芪作用于Hep-2细胞后引起的细胞周期停顿，细胞大量停滞于G2/M期，说明黄芪可通过阻止细胞进入S期生长来诱导喉癌Hep-2细胞凋亡。

凋亡是在基因的调控下进行的，相关基因分为促凋亡基因、抑制凋亡基因和凋亡过程表达基因，与肿瘤的发生、发展和预后密切相关，黄芪素诱导肿瘤细胞凋亡可能与影响上述基因蛋白的表达有关。凋亡抑制蛋白家族(IAP)研究显示黄芪素诱导膀胱癌细胞生长周期停滞和凋亡的可能机制是通过CDC2-survivin通路，即黄芪素显著降低肿瘤细胞cyclin B1的表达，CDC2磷酸化和survivin的表达，从而抑制p38-MAPK和AKT的磷酸化激活［4］。本实验结果证实在喉癌Hep-2细胞内显示随着黄芪作用浓度增大cyclinB1和Bcl-2蛋白表达下降，且随浓度增加而明显下降。说明黄芪可通过抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达起到促凋亡作用。

本研究首次证明黄芪能够诱导Hep-2细胞发生凋亡，并有效抑制Hep-2细胞的活性。黄芪对Hep-2细胞的抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性。黄芪可以通过调节cyclin B1和Bcl-2来抑制喉癌Hep-2细胞增殖并诱导其凋亡，在未来喉癌的治疗中，黄芪有着广阔的应用前景。

:

［1］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149 -153.

［2］Chao JI，Su WC，Liu HF.Baicale ininduces cancer cell death and proliferation retardation by the inhibition of CDC2 kinase and surviving associated with opposite role of p38 mitogen - activated protein kinase and AKT［J］.Mol CancerTher，2007，6(11):3039 -3048.

［3］Leung HW，Yang WH，Lai MY，et al.Inhibition of 12-lipoxygenase during baicalein induced human lung non small carcinoma H460 cell apoptosis［J］.Food ChemToxicol，2007，45(3):403 -411.

［4］Pidgeon GP，Kandouz M，Meram A，et al.Mechanisms controlling cell cycle arrest and induction of apoptosis after 12-lipoxygenase inhibition in prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2002，62(9):2721 -2727.

Effects of astragalus on cell proliferation and apoptosis in Hep-2 cells in vitro

SONG Yan，LIU Xiu-ping，BAI Wei-liang，JI Wen-yue
(Department of Otolaryngology，Sheng-Jing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China)

Abstract:［Objective］To investigate the mechanism underlying the anticancer activity of Astragalus on human laryngeal cancer.［Method］Hep -2 cells were treated with astragalus in different concentrations for 24 h.MTT assay was used to evaluate cell proliferation.Flow cytometry with PI staining and fluorescent microscopy with Hoechst 33258 staining were used to estimate cell cycle distribution and apoptosis.Expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were evaluated by western blot.［Result］Astragalus inhibited cellular proliferation in a dose dependent manner(P＜ 0.05).Flowcytometry analysis showed that treatment with astragalus resulted in accumulation cells at the G2/M phase of the cell cycle and cell apoptosis in a dose dependent manner(P＜0.05).Marked morphological changes of cell apoptosis including condensation of chromatin，nuclear fragmentation and apoptotic bodies were observed clearly by Hoechst 33258 staining.Western blot analysis demonstrated that the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were suppressed significantly.［Conclusion］Astragalus inhibited Hep-2 cells proliferation and induced them apoptosis by down regulating the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1.

Key words:astragalus;laryngeal carcinoma;apoptosis

R735.7

A

1671-7295(2012)05-0432-04

辽宁省自然科学基金(20082105)

2012-06-04;

2012-09-03

宋 岩(1982-)，女，辽宁沈阳人，博士。E-mail:songy1@sj-hospital.org

季文樾，主任医师。E-mail:jiwy@sj-hospital.org