冬虫夏草对阿霉素肾病大鼠肾脏氧化应激的影响

王 英

慢性肾脏病(CKD)发病率在我国逐年增多，部分患者最终会进展至终末期肾衰竭。因此，防治CKD已成为当前肾脏病领域研究的热点问题。阿霉素肾病大鼠肾脏组织损伤的演变过程与人类肾脏病肾损害的慢性病理过程相似，也是研究慢性肾脏病肾小球硬化的经典模型。氧化应激在CKD病理生理过程中发挥着重要作用，抑制氧化应激反应已成为减轻肾脏损伤的关键。研究表明，冬虫夏草具有改善细胞代谢，调节脂代谢、抗氧化应激及抗纤维化等作用。本研究建立阿霉素肾病大鼠动物模型，观察给予冬虫夏草干预后大鼠肾组织抗氧化成分变化，探讨其对肾损伤的保护作用及可能机制，为CKD的治疗寻找新的途径和手段。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂:盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司);冬虫夏草菌丝粉(杭州中美华东制药有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);其余普通试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器:日立7170A全自动生化分析仪;UV-754紫外分光光度计;光学显微镜(OLYMPUS)。

1.1.3 动物:雄性Wistar大鼠28只，8周龄，体质量200～250g。

1.2 模型的建立、分组及给药方法 适应性饲养1周，所有大鼠随机分为对照组(8只)、模型组(10只)和治疗组(10只)。模型组和治疗组大鼠，10%异戊巴比妥钠溶液按1ml/kg量腹腔注射麻醉，腹部常规消毒，取左旁正中切口，切开皮肤，逐层进入腹腔，暴露左侧肾脏，分离肾包膜，夹闭肾蒂后行肾脏切除，逐层关腹。对照组仅麻醉后打开腹腔，剥离肾包膜后即关腹，未行左肾切除术。将阿霉素用生理盐水配制成0.2%溶液(1ml溶液中含2mg阿霉素)。于术后第7天按5mg/kg经尾静脉注射阿霉素，术后第28天按3mg/kg再次经尾静脉注射阿霉素，对照组注射等量生理盐水。治疗组大鼠，于第一次尾静脉注射阿霉素后给予冬虫夏草菌丝粉溶于蒸馏水5g/(kg·d)灌胃治疗，共12周。模型组与对照组予等量清水灌胃。

1.3 标本收集 12周末用代谢笼准确收集24小时尿，离心保存于-70℃冰箱中待测;心脏采血，4℃离心后保存于-70℃冰箱待测;4℃预冷的生理盐水反复灌洗右肾至颜色变苍白，分离肾周包膜和筋膜，部分肾组织10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成厚度3μm切片，HE及PAS染色行肾脏病理检查。其余肾组织分别切成小块，置于液氮中冻透，然后转入-70℃冰箱中待测。

1.4 观察指标及测定方法 尿蛋白测定采用柳氮磺酸比浊法，尿肌酐测定采用苦味酸法，尿MDA测定采用硫代巴比妥酸法(Thibabituric Acid，TBA);血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)采用日立7170A自动生化分析仪进行检测。计算肌酐清除率(Ccr)=尿肌酐×每分钟尿量/血肌酐。

肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index，GSI)计算:采用半定量的RAIJ法［3］，0=肾小球无病变，1=肾小球不超过25%受损，2=肾小球26% ～50%受损，3=肾小球51% ～75%受损，4=肾小球超过75%受损，每张切片至少计数20个肾小球积分，取均值×100。按如下公式计算肾小球硬化指数:GSI=［(1×n1)+(2×n2)+(3×n3)+(4×n4)］/每张切片肾小球总数×100。

肾组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性测定:取肾皮质0.5克在冰浴条件下用冷生理盐水制成10%组织匀浆，低温离心机离心，取上清液待测。MDA采用TBA法，SOD活力采用联苯三酚自氧化法，GSH-Px采用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)偶联法，测定步骤严格按照试剂说明书进行。

2.结果

2.1 一般情况 模型组和治疗组大鼠在注射阿霉素后出现毛色差、蜷缩拱背、体重增长缓慢、精神萎顿等表现。本实验过程中，模型组大鼠死亡2只，治疗组大鼠死亡1只，实验结束时，共剩余大鼠25只:对照组8只，模型组8只，治疗组9只。

2.2 各组大鼠尿蛋白及肾功能变化 模型组大鼠24小时尿蛋白定量、Scr和BUN水平较假手术对照组明显升高(P＜0.05)，肌酐清除率降低(P＜0.05)，表明AIN大鼠造模成功。予冬虫夏草灌胃治疗12周后，24小时尿蛋白定量显著减少(P＜0.05);Scr和BUN水平明显下降(P＜0.05)，但仍高于假手术对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 三组大鼠24小时尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮及肌酐清除率的变化()

表1 三组大鼠24小时尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮及肌酐清除率的变化()

注:*与对照组比，P ＜0.05，#与模型组比，P ＜0.05。

组别 n 24小时尿蛋白定量(mg) SCr(μmol/L) BUN(mmol/L) Ccr(ml/min)对照组 8 15.96±3.82 45.36±6.98 5.87±0.62 5.21±0.32模型组 8 443.29±46.82* 104.68±13.53* 20.99±3.81* 1.11±0.05*治疗组 9 319.75±32.51#* 86.55±8.02#* 11.04±2.24#* 2.35±0.34#*

2.3 各组大鼠肾小球硬化指数的比较 假手术对照组、模型组、治疗组肾小球硬化指数分别为19.78±5.28，152.59±33.54，95.08±25.34。治疗组肾小球硬化程度比模型组明显减轻，差异具有显著性(P＜0.05)，但仍重于假手术对照组(P＜0.05)。

2.4 各组大鼠肾组织与尿中MDA含量及肾组织SOD、GSH-Px活性的比较 模型组大鼠肾组织和尿中MDA含量较假手术对照组明显增加(P＜0.05)，而肾组织SOD和GSH-Px活性则显著下降(P＜0.05)，提示AIN大鼠肾脏氧化水平升高，处于氧化应激状态;经冬虫夏草治疗后，大鼠肾组织和尿中MDA含量下降，肾组织SOD和GSH-Px活性增加，差异具有显著性(P＜0.05)，见表2。

表2 三组大鼠肾组织与尿中MDA含量及肾组织SOD、GSH－Px活性变化()

表2 三组大鼠肾组织与尿中MDA含量及肾组织SOD、GSH－Px活性变化()

注:*与对照组比，P ＜0.05，#与模型组比，P ＜0.05。

组别 n MDA(肾)(nmol/24h) MDA(尿)(nmol/mg Prot) SOD(U/mg Prot) GSH-Px(U/mg Prot)对照组 8 233.80±15.70 2.61±0.52 105.63±11.02 3.08±0.06模型组 8 545.30±29.40* 6.23±0.87* 42.34±5.46* 1.66±0.04*治疗组 9 367.20±23.30#* 3.24±0.46#* 73.67±6.52#* 1.93±0.08#*

3.讨论

本实验所采用的动物模型是将大鼠左肾摘除，而后重复注射ADR诱导的加速的肾小球硬化模型。该模型鼠间差异小，重复性和稳定性好，目前被认为是研究CKD进展较理想的动物模型［1］。本实验结果显示，模型组大鼠尿蛋白明显增加，血尿素氮和肌酐明显升高，肌酐清除率下降，肾脏病理显示模型组肾小球硬化指数明显升高，细胞外基质沉积增加，表现为肾小球硬化，表明模型制备成功。

肾脏氧供应丰富，氧自由基产生的机会较多，现己公认，活性氧(ROS)对肾组织的损伤作用是肾脏病变的主要发病机制之一，甚至是许多细胞因子损伤肾组织的最终介质。以往许多研究［2～4］表明在CKD进展过程中，氧化应激发挥着重要的作用。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织和尿中MDA含量显著升高，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明显下降，说明在该阿霉素肾病大鼠肾脏ROS产生增加，其抗氧化能力下降，导致活性氧在肾脏堆积，造成肾脏损伤，与文献报道一致［3］。

冬虫夏草是一种传统中药，含有多糖、氨基酸、脂肪酸及多种微量元素，应用于慢性肾脏病的治疗已有逾千年的历史。已有研究证实冬虫夏草能抑制自发性高血压大鼠肾脏氧化应激［5］，能减少糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子和结缔组织生长因子的表达［6］。但对阿霉素肾病大鼠肾损伤保护作用及机制目前尚未见报道。本研究结果显示，经冬虫夏草治疗后，阿霉素肾病大鼠尿蛋白明显减少，血尿素氮和肌酐下降，肌酐清除率升高，肾小球硬化指数明显降低，提示冬虫夏草对阿霉素肾病大鼠肾损伤具有保护作用。进一步的研究结果表明在冬虫夏草干预下，阿霉素肾病大鼠肾组织和尿中MDA明显减少，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明显增强，提示冬虫夏草能抑制阿霉素肾病大鼠肾脏氧化应激，减轻肾脏损伤。

综上所述，冬虫夏草可减轻阿霉素肾病大鼠的肾脏损害，其机制可能与拮抗肾脏氧化应激有关。本研究结果可能为CKD的防治提供新的思路和手段。

1 王泰华，钱家麒.阿霉素肾病肾硬化动物模型的实验改进［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6:191-193.

2 Masami S，Hideo H，Maki W，et al.Uremic Toxins Overload AcceleratesRenal Damage in a Rat Model of ChronicRenal Failure［J］.Nephron Exp Nephrol，2003，95:111-118.

3 Ceyssens B，Pauwels M，Meulemans B，et al.Increased oxidative stress in the mouse adriamycin model of glomerulosclerosis is accompanied by deposition of ferric iron and altered GGT activity in renal cortex［J］.Ren Fail，2004，26:21-27.

4 Li HY，Hou FF，Zhang X，et al.Advanced oxidation protein products accelerate renal fibrosis in a remnant kidney model［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18:528-538.

5 唐荣，周巧玲.冬虫夏草对自发性高血压大鼠klotho表达及氧化应激的影响［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2010，19(4):338-343.

6 周巧玲，刘抗寒，王衍慧.冬虫夏草对糖尿病肾病模型鼠肾组织转化生长因子B1、结缔组织生长因子表达的影响［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15(5):443-446.