RNA干扰沉默survivin基因对人肺癌细胞侵袭和Akt信号通路的影响

徐永中 朱 灵 范 钰 焦志军 (江苏大学附属医院，江苏 镇江 2200)

近年研究发现，survivin与肺癌发生发展密切相关〔1，2〕。但其内在机制尚不清楚。小干扰RNA(siRNA)又称RNA干涉(RNAi)，能够使基因表达的mRNA被相应的双链RNA分子敲除，其效果要远强于正义和反义RNA。研究表明，参与这种RNAi作用的主要分子是双链RNA，在细胞内以21～23个核苷酸的形式发挥作用，且已有人工合成的双链siRNA，具有明显的敲除相应基因mRNA的效果〔3〕。本研究采用针对survivin基因的siRNA转染处理人肺癌细胞，观察对肺癌侵袭和Akt信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞，江苏大学附属人民医院肿瘤研究所冻存。survivinsiRNA序列:5'-AAGCAUUCGUCCGGUUGCGCU-3'〔4〕，由上海生工生物工程公司合成。survivin单克隆抗体，购自 Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养及转染 肺癌A549细胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1 d，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1 ml/孔，培养过夜。次日进行转染。基本操作按照说明书进行。分组:(1)siRNA组:含10%胎牛血清的RPMI 1640中含不同浓度(0.75、1.50和3.00 nmol/L)的已用脂质体包埋的siRNA。(2)空白对照组:siRNA组的siRNA用RPMI 1640替代。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。

1.3 方法

1.3.1 survivin基因mRNA水平检测 应用TRIzol抽提细胞总RNA，取总RNA 1 μg，以oligo dT为引物逆转录合成 cDNA第一链，以此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书。引物序列为:上游:5'-ATTTGAATCGCGGGACCC-3';下游:5'-GAGAAAGGGCTGCCA GGC-3'。6-羟基荧光素(FAM)探针:5'-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3'-TAMRA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。PCR反应条件为:95℃预变性3 min，95℃，30 s;52℃，45 s;72℃，45 s;35 个循环后再 72C 延伸7 min。实时定量PCR结果参照文献〔5〕方法计算。

1.3.2 survivin基因蛋白水平检测 提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后，以β-肌动蛋白(β-actin)为内对照，进行常规Western印迹检测。

1.3.3 软琼脂集落形成实验 常规进行软琼脂集落培养实验，观测survivin siRNA对肺癌细胞锚着不依赖性增殖的影响。

1.3.4 体外侵袭实验 参照Albini等〔6〕的方法。在改良的Boyden小室中进行，Boyden小室的上下室之间隔以直径为3 mm的聚碳酸酯膜(PVP孔径为8 μm)，膜上铺匀1∶2稀释的基底膜胶。下室加预先制备的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)培养上清液作为趋化因子，上室加入50～800 μl待测的肿瘤细胞悬液。置于37℃、5%CO2培养箱中温育12 h，弃去上室液体，取出聚碳酸酯膜，用棉签仔细擦尽膜上Matrigel及未穿过的细胞，甲醛固定5 min，苏木素-伊红(HE)染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

1.3.5 细胞Akt磷酸化水平检测 提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后，以总Akt为对照，进行常规Western印迹检测。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，所测得的数据用表示。

2 结果

2.1 siRNA转染对survivin基因的影响 采用定量PCR和Western印迹检测结果发现，与对照组细胞比较，siRNA组mRNA和蛋白水平明显降低。见图1，图2。

图1 survivin siRNA转染对肺癌A549细胞survivin mRNA水平的影响

图2 survivin siRNA转染对肺癌A549细胞survivin蛋白水平的影响(48 h)

2.2 软琼脂集落形成实验 肺癌A549细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落，而经siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少。当 siRNA浓度为 0.75、1.50、3.00 nmol/L时集落数分别为18±1.9、12±1.8、7±1.6，与对照组集落数27±2.1比较，siRNA组软琼脂集落形成数明显降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 survivin siRNA对肺癌细胞侵袭的影响 收集转染48 h的细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况，结果发现，当siRNA浓度为0.75、1.50、3.00 nmol/L时，穿膜细胞数分别为39±1.5、25±1.6、12±1.8，与对照组集落数 56±2.2比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降(P＜0.05，P＜0.01)。

2.4 survivin siRNA对肺癌细胞Akt信号通路的影响 Western印迹结果显示，A549细胞有较高水平的磷酸化，经siRNA转染处理后，磷酸化水平明显降低。见图3。

图3 siRNA(3 nmol/L)对肺癌细胞Akt信号通路的影响

3 讨论

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族的重要成员。survivin在胚胎发育过程中表达，在发育后的成年组织中不表达，但它在许多转化的细胞系和许多肿瘤中重新表达〔6〕。survivin在卵巢癌、喉癌、乳腺癌、胆管癌中起重要的作用，是一个重要的预后指标〔7〕。与口腔癌、胃癌、前列腺癌、肺癌转移有关〔8〕。但尚不清楚其内在机制。本研究发现，survivin siRNA可以抑制肺癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭能力，提示survivin基因在人肺癌细胞侵袭中可能起到重要的作用。

正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性。肿瘤细胞可以锚着不依赖性生长。肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着依赖性的特性，且与其恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本研究发现，肺癌细胞经不同浓度的survivin siRNA处理后，可明显抑制癌细胞在软琼脂集落的形成，且呈剂量依赖性。Boyden小室模型检测发现，经siRNA处理后的肺癌细胞穿膜细胞数减少，且呈浓度依赖性。说明，survivin siRNA可一定程度上抑制肺癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。

癌细胞侵袭是一个复杂的过程，涉及很多机制。研究发现，Akt信号通路在许多恶性肿瘤细胞增殖侵袭中起着重要作用。Akt也称蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其激酶结构域与蛋白激酶A、C都有70%的同源性〔9〕。它可以被许多生长因子如血小板衍生生长因子、表皮生长因子和神经生长因子等通过PI-3 K途径激活，激活的Akt可以磷酸化胱冬蛋白酶-9(caspase-9)前体蛋白和Bad而使它们失活，从而在保护细胞免于凋亡中起着重要作用〔10〕。本研究发现，survivin siRNA可对肺癌细胞Akt磷酸化水平有效地抑制，且呈浓度依赖性。

本研究提示，抑制Akt磷酸化水平，是survivin siRNA下调

人

肺癌细胞锚着不依赖性增殖和恶性侵袭的重要机制之一。

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