肠淋巴液引流对创伤失血性休克大鼠多器官自由基与一氧化氮的影响

常海峰 牛春雨 赵自刚 韩 瑞 张玉平 杜舒婷 杜会博

(河北北方学院微循环研究所，河北 张家口 075029)

研究表明，休克肠淋巴液是加重组织器官损伤的重要因素〔1～3〕，结扎肠淋巴管，可减少失血性休克以及二次打击大鼠重要器官肺、肾、心肌、肝组织炎症因子的产生，降低自由基损伤，改善组织器官功能〔4～8〕，其机制与减少肠淋巴液携带的多种毒性物质回流至全身有关〔9〕;Deitch课题组也报道失血性休克复苏后，肠系膜淋巴液可活化在体和离体的中性粒细胞，使之通透性增高，促进急性肺损伤，如事先行肠系膜淋巴管结扎，则可防止肺损伤〔10，11〕;虽然肠淋巴管结扎阻断了休克淋巴液回流至全身，但在临床上的应用值得考虑。为此，课题组采用淋巴液引流术，发现休克淋巴液引流可提高创伤失血性休克(T/HS)大鼠平均动脉血压(MAP)，减轻多个器官组织损伤的程度，改善器官功能，其机制与改善能量代谢有关〔12〕。本文进一步从自由基与一氧化氮角度，探讨休克淋巴液引流减轻T/HS大鼠多器官损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 18只健康清洁级Wistar雄性大鼠，体重250～330 g(购自中国医学科学院动物繁殖中心)，以随机数字表法随机均分为:对照组(仅麻醉及手术);淋巴液引流组与淋巴液回流组，后两组复制T/HS模型，淋巴液引流组行肠淋巴液引流。

1.2 创伤失血性休克模型复制 大鼠全身麻醉(肌肉注射质量分数1%戊巴比妥钠，剂量50 mg/kg)后，行股部无菌手术，分离右侧股动脉，插三通管连接生物信号采集系统(成都仪器厂)，记录 MAP;分离股静脉，注射质量分数 0.5%肝素(1 ml/kg，700 U/ml)全身抗凝。腹部手术，分离肠淋巴管，行肠淋巴管插管、引流休克肠淋巴液至实验结束作为淋巴液引流组;不插管、保证淋巴液回流作为淋巴液回流组。待MAP稳定10 min后，淋巴液引流组及回流组大鼠以ZCZ-50型自动抽注机(浙江医科大学医学仪器厂)自股动脉匀速放血至40 mmHg，5 min完成，保留备回输;以调整放血量维持低血压90 min后，淋巴液引流组及回流组均以WZF-250F2型双道微量注射泵(浙江大学医学仪器有限公司)自股静脉缓慢回输放出血液及林格氏液(量为全血量)，时间控制在20 min左右。对照组仅麻醉、股部、腹部手术，不放血及输液。

1.3 标本留取及指标检测 大鼠于输液复苏后3 h(或相应时间点)，选择固定位置留取肾、肝、肺、心肌组织，应用FJ-200型高速分散均质机(上海标本模型厂)制备10%组织匀浆，应用高速低温离心机(德国科峻)以2 500 r/min离心10 min，取上清液备检。应用改良硫代巴比妥酸微量法、硝酸还原酶法分别检测各器官组织匀浆丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)(南京建成)含量，组织匀浆蛋白采用考马斯亮蓝法定量。

2 结果

2.1 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆MDA含量的影响 淋巴液回流组的肺、肾、心肌、肝以及淋巴液引流组心肌组织匀浆的MDA含量均显著高于假手术组(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流组肺、肾、心肌、肝组织匀浆的MDA含量均显著低于淋巴液回流组(P＜0.01)。见表1。

表1 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆MDA含量的影响(nmol/mg，，n=6)

表1 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆MDA含量的影响(nmol/mg，，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与淋巴液回流组比较:3)P＜0.01，下表同

1.40±0.21 1.71±0.31 1.78±0.12 1.42±0.15淋巴液回流组2.62±0.602)2.95±0.612)3.60±0.612)3.34±0.822)淋巴液引流组1.38±0.243)1.82±0.503)1.81±0.753)2.09±0.651)3)组别 肺 肾 肝 心肌对照组

2.2 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆NO含量的影响 淋巴液回流组的肺、肾、心肌、肝以及淋巴液引流组肾组织匀浆的NO含量均显著高于假手术组(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流组肺、肾、心肌、肝组织匀浆的NO含量均显著低于淋巴液回流组(P＜0.01)。见表2。

表2 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆NO含量的影响(nmol/mg，，n=6)

表2 休克淋巴液引流对T/HS大鼠器官组织匀浆NO含量的影响(nmol/mg，，n=6)

1.60±0.20 2.05±0.19 1.68±0.30 1.98±0.38淋巴液回流组2.51±0.572)3.28±0.442)4.02±0.702)2.66±0.391)淋巴液引流组1.44±0.563)2.46±0.341)3)2.11±0.393)1.57±0.463)组别 肺 肾 肝 心肌对照组

3 讨论

恢复组织灌流是氧自由基大量产生与释放的过程，缺血-再灌注引起的氧自由基损伤在休克发病过程中起重要作用〔13〕。内皮细胞是缺血-再灌注过程中氧自由基的最早来源，氧自由基激活补体，补体系统被激活后，补体活化产物(C3a、C3b、C5a等)可以刺激巨噬细胞和中性粒细胞释放细胞因子和氧自由基，后者进一步攻击内皮细胞而加重损伤。本研究结果表明，由于失血，T/HS大鼠在休克再灌注后即有大量自由基生成，自由基产物MDA在肺、肾、肝、心肌等组织的含量显著增多，结果提示自由基损伤是T/HS大鼠多器官损伤的重要机制。淋巴液引流组将休克肠淋巴液引流至体外，减少了休克肠淋巴液中毒性物质的肠源性移位，抑制了自由基的产生与释放，降低了各组织器官的MDA含量，从而减轻自由基对各器官组织细胞的损伤作用。

NO作为一种具有多重生理功能的介质，参与调节血管和气管的平滑肌舒张、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和红细胞聚集黏附、神经细胞间的信息传递、调节细胞黏附分子的表达、机体免疫防御、细胞溶解等多方面发挥重要的作用。近年来的研究表明，NO在休克的病理生理过程中发挥了重要作用，在内毒素、缺氧等刺激因素以及细胞因子的作用下，由中性粒细胞、内皮细胞、巨噬细胞等在iNOS催化作用下合成，与血管反应性下降、器官功能衰竭及病死率等密切相关〔14〕，而NO引起炎症反应的瀑布效应，是引起导致多器官损伤的重要原因;降低NO水平可减轻MODS大鼠与失血性休克的器官损伤〔4～7，15〕。本研究结果显示，手术创伤、失血、液体复苏后，T/HS大鼠肝、肾、心肌、肺等重要器官的NO含量明显升高，提示NO参与T/HS的器官功能障碍与损伤;休克淋巴液引流后，上述器官的NO含量下降，说明休克淋巴液引流减少了NO的合成与释放;同时，由于NO可通过刺激中性粒细胞产生呼吸爆发及脱颗粒，释放氧自由基和蛋白水解酶，加重组织器官的自由基损伤，形成自由基与炎症的级联反应，因此休克淋巴液引流降低组织自由基损伤也有可能是通过减少NO实现的。

从本文研究结果来看，休克肠淋巴液引流降低自由基损伤与NO水平的作用与肠淋巴管结扎具有相似的作用;且前期表明，引流休克肠淋巴液引起机体血容量的小量丢失并未对机体产生不良影响，本文为淋巴液引流术的进一步临床应用奠定了实验基础。

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