电针对脑缺血再灌注模型大鼠纹状体NMDA受体NR2亚基蛋白表达的影响

沈梅红 刘晓华 项晓人 沈 洁 张 莹 舒兆瑞 李忠仁

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210046)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体属于兴奋性氨基酸-谷氨酸离子型受体的一种，由NR1和NR2两种亚单位组成，NR2是其调节亚单位，对整个受体通道的功能起修饰作用。NMDA受体不仅参与体内神经发育、学习记忆、兴奋性突触等多种生理过程，也参与传递神经元死亡、缺血性脑损伤、血管性痴呆等许多重要的病理过程〔1，2〕。但目前关于针灸对脑组织NMDA受体亚单位的研究主要集中在海马和皮质区上〔3，4〕，而纹状体是大脑中动脉缺血再灌注时的主要受损脑区之一。为此，本文通过观察电针对缺血再灌注后大鼠纹状体NMDA受体调节亚单位NR2A和NR2B蛋白表达的变化，探讨电针对缺血再灌注兴奋性氨基酸毒性的拮抗作用，进一步阐明电针治疗缺血性脑血管疾病的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及脑缺血再灌注动物模型制作 8月龄清洁级SD健康雄性大鼠15只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司〔许可证号:SCXK(沪)2007-0005〕。所有大鼠自由摄食和饮水，生活在昼夜节律为12 h/12 h且保持室温25℃的空间内，适应性喂养至体质量(300±20)g后进行实验。实验过程中对动物的处置符合国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。用数字随机表将动物随机分成制作模型大鼠10只、假手术组大鼠5只。模型动物根据前期研究〔5〕，采用改良Longa线栓大脑中动脉法制作局灶性脑缺血再灌注模型。假手术组大鼠的手术过程，除不插入线栓外，其余步骤与模型组一致。模型制作成功后，随机分成模型组、电针组，各5只。具体如下:①模型组:制作大脑中动脉短暂性缺血再灌注模型，不做治疗。②假手术组:只做手术血管分离，不做血管结扎，不插入线栓及治疗。③电针组:造模同模型组，再灌同时电针“百会”、“大椎”两穴30 min。

1.2 药品与试剂 水合氯醛(AR，批号:30037517)购于国药集团化学试剂有限公司，蒸馏水配制成10%的溶液;多聚甲醛(AR，批号:20071217)购自成都科龙化学试剂厂，用0.01 mol/L PBS配成4%多聚甲醛溶液;多聚赖氨酸、0.01 mol/L PBS、柠檬酸盐抗原修复液、二抗〔即用型二步法(非生物素)检测试剂盒〕、3%过氧化氢溶液及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗NR2A、NR2B单克隆抗体购于美国Abcam公司。

1.3 实验仪器 Leica TP 1020型生物组织脱水机(德国);Leica RM 2145型石蜡切片机(德国);OLYMPUS-BX60生物组织显微镜(日本);OLYMPUS DP 71图像获取系统(日本);JD 801形态学图像分析系统软件(江苏省捷达科技发展有限公司);DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);WQ 1002K电针仪(安隆光电技术公司);华佗牌不锈钢一次性毫针(φ0.35 mm×25 mm，苏州医疗用品有限公司)。

1.4 电针方法 电针组大鼠在成功制备脑缺血再灌注模型后进行电针治疗“百会”、“大椎”两穴，选穴标准依据《实验针灸学》所附大鼠穴位图谱。“百会”穴平刺，“大椎”穴斜刺(约30°角)，深度均为10 mm。捻转刺激30 s后，接电针仪，“百会”接负极，“大椎”接正极。刺激参数:连续波，频率3Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度(电流强度1～3 mA，电压1～3 V)。时间:30 min。

1.5 取材 各组大鼠再灌注24 h，经10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射深度麻醉后，开胸先后用0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲醛固定液各200 ml经左心室及升主动脉灌流，开颅取脑，置4%多聚甲醛溶液中固定过夜备用。将大脑沿冠状面切成5等份脑片，取头侧第二片脑组织，浸泡在75%乙醇过夜。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。

1.6 HE染色及NR2A、NR2B蛋白表达 将已包埋好的石蜡块作冠状面切片(片厚5 μm)，从出现纹状体完整结构开始取3张切片，分别用于HE染色及 NR2A、NR2B免疫组化检测。NR2A、NR2B蛋白表达检测方法，同参考文献〔3〕进行操作。

2 结果

2.1 大鼠脑组织纹状体区形态学观察 由图1可观察到:假手术组大鼠脑组织纹状体区有大量神经细胞分布，颗粒细胞呈椭圆形，细胞质不丰富，核质比大，核淡染清晰;可见少量锥体细胞，有长的突起，核浆比小，细胞核为圆形或椭圆形，着色为浅蓝色，核仁深染，未见炎性细胞浸润及细胞空泡变性和细胞坏死等。而模型组大鼠纹状体区神经细胞分布较少，其中许多细胞胞体缩小、胞核固缩、深染，可见神经细胞坏死和凋亡，血管周围、神经细胞和纤维束水肿。电针组大鼠纹状体神经细胞内核固缩现象减轻，大小接近假手术组，神经细胞分布情况接近于假手术组。

图1 各组大鼠纹状体形态学观察(HE，×400)

2.2 大鼠局灶性脑缺血后纹状体区NR2A、NR2B表达

2.2.1 NR2A阳性细胞表达及图像分析结果 由图2可知，假手术组NR2A蛋白在大鼠纹状体神经细胞有中等强度的阳性表达，阳性细胞多呈棕褐色，胞浆浓染，细胞排列分散在纹状体阴性神经细胞中;与假手术组相比，模型组细胞排列稀疏，阳性细胞少见，胞质淡染;与模型组相比，电针组的阳性细胞数增多，胞质染色变深，细胞排列分散在纹状体阴性细胞中。从表1可知:与假手术组相比，模型组大鼠受损侧纹状体中表达NR2A蛋白的阳性细胞数、平均光密度值明显降低，平均灰度值明显升高。与模型组比较，电针组纹状体中NR2A阳性细胞数及细胞平均光密度值明显增加，平均灰度值明显降低，但仍与假手术组存在差异。

图2 各组大鼠纹状体NR2A表达情况(DAB，×400)

表1 各组大鼠纹状体中NR2A阳性细胞数、平均灰度、平均光密度()

表1 各组大鼠纹状体中NR2A阳性细胞数、平均灰度、平均光密度()

与假手术组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05，下表同

阳性细胞数 平均灰度 平均光密度假手术组组别 n 5 96.25±7.04 113.10±11.08 0.36±0.04模型组 5 58.60±2.301) 147.35±6.341) 0.24±0.021)电针组 5 72.20±12.721)2)132.03±6.701)2) 0.29±0.021)2)

2.2.2 NR2B阳性细胞表达及图像分析结果 由图3可知，假手术组中NR2B蛋白在细胞体中有少量阳性表达，可见其散在分布于纹状体神经元中，胞质染色较淡;与假手术组相比，模型组纹状体神经元中有高度表达，细胞排列紊乱，可见大量的阳性细胞，多呈棕褐色，胞质深染;与模型组相比，电针组的阳性神经元数目减少，染色变淡，细胞排列较稀疏。从表2可知大鼠纹状体中NR2B表达结果:与假手术组相比，模型组纹状体组织表达NR2B的阳性细胞数量、阳性细胞的平均光密度值明显升高，平均灰度值明显降低;与模型组比较，电针组纹状体NR2B阳性细胞数、平均光密度值明显降低，平均灰度值明显升高。

图3 各组大鼠纹状体NR2B表达情况(DAB，×400)

表2 各组大鼠纹状体中NR2B阳性细胞数、平均灰度、平均光密度()

表2 各组大鼠纹状体中NR2B阳性细胞数、平均灰度、平均光密度()

阳性细胞数 平均灰度 平均光密度假手术组组别 n 5 61.00±4.55 142.08±8.89 0.25±0.02模型组 5 117.60±6.881) 109.68±9.111) 0.37±0.041)电针组 5 65.60±15.142) 126.00±6.301)2) 0.31±0.021)2)

3 讨论

虽然脑缺血再灌注损伤后进行神经行为学评分，操作简便，可直接观察干预措施的效果，易于广泛应用，但与脑损伤并不完全同步;而形态学观察可作为评价脑缺血损伤情况的金指标。本研究说明造模可以促进神经元的损伤，而电针治疗可以减少受损神经元数，减轻缺血后引起的脑损伤。

各种原因引起的脑缺血缺氧，其受损局部组织的神经元可释放大量的兴奋性氨基酸(EAA)，主要是谷氨酸(Glu)。再加上EAA重摄取减少以及死亡细胞大量溢出EAA，神经元坏死后小胶质细胞也可产生大量的Glu〔6〕，致使细胞间隙的EAA浓度很快增加。而细胞间隙中超常量的EAA持续强烈地作用于细胞膜上的Glu受体亚型-NMDA受体，导致Na+、Ca2+经受体门控通道大量内流，引起Ca2+超载，进而触发一系列Ca2+依赖性反应，造成神经元进一步损伤。因此认为在缺血性脑损伤中NMDA受体发挥着关键作用，而该受体通道的调控被认为是目前治疗缺血性脑卒中的重要靶点〔7〕。从理论上讲，若能抑制NMDA受体的活性，就能减少钙内流，有效地阻止NMDA受体介导的缺血性脑损伤的发生。

NMDA受体是由不同亚单位组成的异聚体，目前已发现生物体内有3种NMDA受体亚基，分别是NR1、NR2和NR3。其中NR3主要在发育中的中枢神经系统中表达，不形成Glu激活通道。NR1是NMDA受体的功能亚基，在大鼠中枢神经系统内广泛分布，NR2是调节亚基，独立存在时并不表达，它总是伴随NR1存在于特定的脑区，增强NR1对兴奋性氨基酸的反应〔8〕，而NR2亚基包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D等亚单位。在成年大脑中，NR2A在大部分中枢神经系统区域都有表达，而NR2B主要局限于前脑，NR2D在中枢神经系统中的表达慢慢减少，主要在丘脑和脑干，NR2C则在小脑。NR2A和NR2B均能调节NMDA受体的活性，但两者在缺血性脑损伤中所发挥的作用是完全相反的〔9〕:NR2A促进神经保护作用的发挥，其激活有利于神经元的再生;而NR2B可介导自由基级联反应，产生兴奋性毒性作用，促进神经细胞凋亡的发生，且NR2B数目愈多，神经元对兴奋性氨基酸的毒性作用愈敏感。为此，本研究设计并对照观察脑缺血再灌注大鼠在再灌注24 h时纹状体中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的蛋白表达以及电针干预后两者的变化。

本文表明脑缺血再灌注可引起大鼠受损侧纹状体组织中NMDA受体亚单位蛋白表达的改变，这与徐铁军等〔10〕研究前脑缺血再灌流后大鼠海马NMDA受体亚单位NR2A和NR2B蛋白质表达结果基本相符。而与模型组大鼠相比，给予电针“大椎”、“百会”穴治疗后的大鼠纹状体组织NR2A表达细胞数及含量均明显升高，表达NR2B的细胞数及含量均明显下降。结合前期研究推测，电针一方面可能通过激活局部神经元表达大量NR2A受体蛋白，促进受损纹状体区域神经元再生;另一方面通过阻抑NR2B受体蛋白的过量表达，来抑制自由基的大量生成，降低局部神经元对兴奋性氨基酸毒性作用的敏感性，从而调节NMDA受体复合物的整体功能活性，减少NMDA受体介导的兴奋性氨基酸毒性反应，减轻脑缺血再灌注引起的局灶性脑损伤，发挥一定的脑神经保护作用。为了更深入探讨电针对脑缺血再灌注大鼠的NMDA受体的影响，可采用实时荧光RT-PCR等分子生物学技术进一步研究。

1 王玉梅，刘永平，曹 凯，等.黄芩茎叶黄酮对慢性脑缺血大鼠脑内NMDA受体和VEGF表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2012;28(2):353-7.

2 韦登明，贾学敏，尹向旭，等.电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞谷氨酸、NMDAR表达的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(19):3738-40.

3 刘晓华，沈梅红，项晓人，等.电针对脑缺血再灌注模型大鼠海马NMDA受体2A、2B亚型表达的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2011;38(10):2080-2.

4 陈泽斌，邹 峰，袁 芳，等.针刺预处理对脑缺血再灌注大鼠顶皮质NR2A和NR2B蛋白表达的影响〔J〕.中国中西医结合急救杂志，2005;12(2):79-83.

5 沈梅红，李忠仁，项晓人，等.电针对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层超微结构的影响〔J〕.针刺研究，2009;34(3):167-70.

6 Pais TF，Figueiredo C，Peixoto R，et al.Necrotic neurons enhance microglial neurotoxicity through induction of glutami-nase by a MyD88-dependent pathway〔J〕.Neuroinflammation，2008;5(1):43.

7 Pei DS，Wang XT，Liu Y，et al.Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR6-9c peptide containing the TAT protein transduction sequence〔J〕.Brain，2006;129(2):465-79.

8 Prybylowski K，Wenthold RJ.N-Methyl-D-aspartate receptors:sub unit assembly and trafficking to the synapse〔J〕.J Biol Chem，2004;279(11):9673-6.

9 Liu Y，Wong TP，Michelle Aarts.NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo〔J〕.J Neurosci，2007;27(11):2846-57.

10 徐铁军，樊红彬，张凤真，等.前脑缺血再灌流后大鼠海马NMDA受体亚单位NR2A和NR2B蛋白质表达的变化〔J〕.神经解剖学杂志，2004;18(2):110-6.