感染性结石大鼠模型的尿路组织病理学改变

吕建林，徐彦

(1.南京医科大学附属江宁医院泌尿外科，江苏南京 211100;2.江苏省中医院泌尿外科，江苏 南京 210029)

感染性结石形成的先决条件是解脲酶微生物引起的持续性尿路感染，必要条件是解脲酶微生物产生的脲酶对尿中尿素的分解［1-2］。与感染性结石最相关的致病性解脲酶微生物是奇异变形杆菌。奇异变形杆菌及其产生的脲酶对尿路上皮细胞损伤后所导致的一系列病理生理改变以及细胞的适应性反应在感染性结石的形成中起着重要的作用。尿路的病理性损害又成为引发感染性结石形成的因素，并进一步加重尿路感染。本研究目的在于观察实验性大鼠尿路感染性结石形成所导致的尿路组织病理学的改变，以及尿路组织病理学改变对感染性结石成因的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性SD纯种大鼠，体重(180±10)g，由南京青龙山动物饲养厂提供(许可证号:SCXK-2009-0007)。大鼠均在南京大学医学院动物中心清洁级饲养室中饲养，可以自由获取食物及饮水，室温(20±2)℃，湿度50% ～60%。

奇异变形杆菌由南京大学医学院附属军区总医院检验科微生物室提供。

HM 325无水乙醇、甲醛、二甲苯、多聚赖氨酸(南京化学试剂有限公司)，PBS缓冲液和枸橼酸缓冲液(南京生兴生物技术有限公司);苏木素、伊红(美国Sigma公司)，抗兔二抗试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗THP(Tamm-Horsfall蛋白)抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液及异物制备 在血琼脂平板上孵育奇异变形杆菌24 h后，从血琼脂平板上挑出单个菌落，用5 ml盐水制成悬液。在充足光线下，背对着有白色背景与黑色对比线条的卡片，将接种管与0.5号麦氏标准管进行目测比较，将菌悬液调至0.5麦氏浊度。此时菌悬液内培养物大约含1～2×108CFU·ml－1。再将菌悬液用盐水1∶10稀释，获得107CFU·ml－1的菌液。另取聚乙烯管(长4 mm，直径为0.5 mm)，浸泡于107CFU ml－1的细菌菌悬液中，置于恒温箱中共同培养8 h以上。

1.2.2 模型分组 为排除非健康实验动物对实验结果的影响，大鼠适应性饲养5 d后分组造模。SD雄性大鼠24只，分为3组。空白对照组(n=4):每天普通饲料喂养(10 g·只－1)，膀胱内不置入任何异物。假手术组(n=10):以 25%乌尔坦(1.0 g·kg－1)腹腔注射麻醉，腹部皮肤去毛后以1.5%碘伏消毒，铺无菌手术巾。麻醉满意后取耻骨弓上方下腹部正中切口，切开腹腔，提起膀胱，使用无菌G18穿刺针，于膀胱顶部穿刺入膀胱后直接退出，膀胱内不置异物，关闭腹腔，术后6 h后恢复进食、进水。实验组(n=10):以25%乌尔坦(1.0 g·kg－1)腹腔注射麻醉，腹部皮肤去毛后以1.5%碘伏消毒，铺无菌手术巾。麻醉满意后取耻骨弓上方下腹部正中切口，切开腹腔，提起膀胱，以无菌G18穿刺针于膀胱顶部穿刺入膀胱，经穿刺针内腔，使用推杆将聚乙烯管［此前浸泡于107CFU·ml－1的细菌菌悬液中，置于恒温箱(37℃)中共同培养8 h以上］推入膀胱，退出穿刺针后关闭腹腔，术后6 h后恢复进食、进水。以上各组动物白天均投以充足的普通饲料，自由饮水。

1.2.3 标本获取及组织切片HE染色和免疫组化染色 手术后第21天以过量麻醉方法处死全部大鼠。取下腹部正中切口(长约4 cm)进入腹腔，将大鼠肾脏、输尿管和膀胱分离，提起膀胱底部，分离至尿道近端剪断，取出肾、输尿管、膀胱后，观察脏器大小、表面色泽及结石形成的情况。获取的尿路组织标本立即置于4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋组织标本，4 pm厚切片。(1)HE染色。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇醇化后水洗。苏木素染色5 min，自来水冲洗。盐酸、乙醇分化(提插数下)，自来水浸泡15 min或温水(约50℃)浸泡5 min，伊红染色2 min。常规脱水，透明封片，中性树脂封固。(2)免疫组化染色。组织标本脱蜡:60℃烤箱预热30 min后，二甲苯脱蜡15 min，两次。水化:依次置于 100%、100%、95%、85%、75%乙醇，蒸馏水中水化处理10 min。3%H2O2室温孵育15 min后，1×PBS冲洗3次后，置于0.01 mmol·L－1枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸15 min，蒸馏水浸泡30 min，1×PBS冲洗3次。滴加兔抗THP(H135)抗体(浓度1∶120)，37℃温箱孵育60 min。滴加羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，1×PBS冲洗3次。DAB显色，自来水反复冲洗。苏木素复染，封片。根据Tamm-Horsfall蛋白在髓攀升支粗段和远曲小管近段上皮细胞免疫组化着色度表达进行评分(按照色度学准则，分析免疫组化彩色图像):着色度0～33%评1分，34% ～66%评2分，67% ～100%评3分。

2 结 果

造模术后第2天，实验组大鼠死亡2只，其他各组大鼠无死亡。解剖发现死亡原因为大鼠腹腔重症感染合并尿潴留。术后第21天，以过量麻醉方法处死全部大鼠。肉眼观察，空白对照组与假手术组的肾脏、输尿管无明显变化，膀胱内无结石生成(图1、2)。假手术组膀胱组织在穿刺点局部稍有增厚。实验组大鼠的双侧肾脏明显增大、质暗肿胀，肾表面可见数量不等的微小脓肿，个别肾脏可见较大脓肿突出肾脏表面。肾切面肾盂扩大，黏膜充血、肿胀，肾盂内可见脓性分泌物。输尿管肿胀，内见炎症分泌物。膀胱表面的黏液层被破坏，膀胱壁明显增厚，膀胱表面粗糙糜烂，散在溃疡，局部可见到粟粒样脓肿。膀胱内见结石样物质(图3)。实验组大鼠的组织病理学变化为肾小管细胞发生混浊肿胀，管腔中有红细胞及白细胞管型，肾间质有水肿，部分纤维化(图4)。输尿管上皮中度增生，管腔中见大量中性粒细胞，周围间质中见中性粒细胞以及成纤维细胞(图5)。膀胱组织血管广泛性扩张充血，大量炎细胞浸润，并有组织细胞坏死，膀胱移行上皮呈广泛性增生(图3)。实验组肾脏Tamm-Horsfall蛋白在髓攀升支粗段和远曲小管近段的上皮细胞表达增高(图6)。

图1 空白对照组膀胱 HE×200Fig 1 The control group(bladder)HE×200

图2 空白对照组肾脏 HE×200Fig 2 The control group(kidney)HE×200

图3 实验组膀胱图片 HE×200Fig 3 Experimental group(bladder)HE×200

图4 实验组肾盂图片 HE×200Fig 4 Experimental group(kidney)HE×200

图5 实验组输尿管图片 HE×200Fig 5 Experimental group(ureteral)HE×200

图6 实验组大鼠Tamm-Horsfall免疫组化染色 ×200Fig 6 Immunohistochemistry staining of Tamm-Horsfall protein pression in kidney of rat ×200

3 讨 论

泌尿系结石形成的病因主要分为两类，即代谢性和感染性结石，其中，感染性结石占5% ～15%［1］。感染性结石形成的先决条件是解脲酶微生物引起的持续性尿路感染［2-4］。成功地构建感染性结石的动物模型可以进一步研究解脲酶微生物，及其脲酶对尿路上皮细胞造成损伤后所产生的一系列病理改变，以及尿路上皮细胞的适应性反应。细菌在尿路上皮的拓殖是尿路感染的基础［5］。细菌的拓殖主要依靠其自身的黏附性，这种黏附性与细菌表面的纤毛有密切关系［5-6］。在无尿液膀胱输尿管返流的情况下，奇异变形杆菌通过其表面的纤毛黏附于尿路上皮细胞的甘露糖，并通过趋化作用上行至肾脏，引起肾脏感染［7-9］。

目前，有关解脲酶阳性菌引起的尿路上皮细胞损伤在感染性结石形成过程中的作用，及结石形成后所起的组织细胞变化的机制并不清楚。我们对感染性结石的动物模型观察发现，奇异变形杆菌引起的尿路组织病理学的损害主要表现为肾盂肾炎和膀胱炎。组织形态学变化为肾盂扩大，黏膜充血、肿胀，部分肾实质可见微小脓肿或锥形炎症灶;输尿管肿胀，其内见炎症分泌物;膀胱表面的黏液层被破坏，膀胱表面粗糙糜烂，膀胱壁明显增厚，局部可见到粟粒样脓肿，部分融合成片，膀胱内有大量成形结石形成。肾脏病理学变化为肾小管细胞发生混浊肿胀，管腔中有红细胞及白细胞管型，肾间质有水肿，部分纤维化。膀胱组织血管广泛性扩张充血，大量炎细胞浸润，并有组织细胞坏死。膀胱移行上皮呈广泛性增生。

奇异变形杆菌及其解脲酶产物对尿路的病理损害可能既是尿路感染所造成的结果，又参与了此后的结石的生成。细菌入侵肾脏后，可直接破坏肾盂黏膜及肾小管上皮，受损的上皮细胞坏死脱落后将使肾小管基底膜暴露，为细菌进一步拓殖或尿液中结晶的附着提供了部位。死菌及其碎片可沉积在肾小管上皮表面而加重肾小管的损伤，脱落的上皮细胞可降解为膜碎片与活性下降或死亡的奇异变形杆菌在具有黏性糖蛋白聚集下可成为感染性结石形成的核心［6-8］。此外，受损的肾小管上皮细胞将发生结构和病理变化，其表达的一些大分子物质和蛋白质可发生质和量的改变，从而影响感染性结晶的成核、聚集和滞留。已知的这些大分子物质和蛋白质有Tamm-Horsfall蛋白、尿凝血酶片段-1、CD44、骨桥蛋白、透明质酸、磷脂酞丝氨酸、硫酸乙酞肝素、唾液酸、纤维连接蛋白、白细胞介素-6以及其他一些生化物质，其中比较重要的是Tamm-Horsfall蛋白。

Tamm-Horsfall蛋白只在肾脏小管的亨利袢上升段和远曲小管近段的上皮细胞产生，与糖脂磷脂酰肌醇结合于肾小管管腔周围［10］，并在一种蛋白酶分解后释放于尿中，是尿液中最丰富的蛋白。许多炎症性肾病与Tamm-Horsfall蛋白有关［11］。感染性结石引起的肾脏组织损伤可以导致Tamm-Horsfall蛋白表达增高。我们观察到，大鼠感染性结石模型中肾小管上皮细胞Tamm-Horsfall蛋白表达明显增高。在尿路炎症的条件下，Tamm-Horsfall蛋白可能在对固有免疫细胞的激活的过程中扮演内源性启动子的作用［12］。长期以来，人们意识到Tamm-Horsfall蛋白可能在尿石的形成中起作用，但对其具有促进晶体聚合还是抑制晶体聚合的作用存在争议。其实，Tamm-Horsfall蛋白在尿中是一把双刃剑，在敲除大鼠Tamm-Horsfall蛋白表达基因后，肾脏内有草酸钙结石的形成，此研究［10］结果表明，Tamm-Horsfall蛋白对草酸钙结石的形成具有明显的抑制作用。尿中尿素的浓度对Tamm-Horsfall有影响，其浓度增高可使Tamm-Horsfall蛋白黏性降低，溶解性增加;相反若尿素浓度降低，Tamm-Horsfall蛋白发生聚集，黏性增加且易形成凝胶，有利于成为结石形成的核心。

奇异变形杆菌及其解脲酶对尿路上皮细胞可以造成损伤，损伤后所产生的一系列病理生理改变以及细胞的适应性反应在感染性结石的形成中起了重要的作用。奇异变形杆菌、解脲酶及磷酸胺镁结晶与尿路上皮细胞的相互作用是一个复杂过程。

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