克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析

王永，陈晓鹏，2

(1.南京市浦口区中医院普外科，江苏 南京 211800;2.皖南医学院附属弋矶山医院肝胆外科，安徽芜湖 241000)

乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是一种与肿瘤转移、血管生成等多种病理生理过程密切相关的细胞基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的降解酶［1］。HPSE在大部分肿瘤细胞中呈高表达，在正常的体细胞中不表达。研究发现，利用肿瘤特异性启动子驱动或效应基因能进行肿瘤靶向治疗，如甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子及前列腺膜相关抗原启动子等。但上述启动子只针对特定肿瘤，属于窄谱肿瘤特异性启动子。HPSE基因启动子是最近发现并被证实的具有较广谱肿瘤特异性的启动子，是肿瘤靶向治疗较为理想的驱动工具，但是目前实验结果发现其驱动基因表达的活性不高［2］，因此，改造HPSE启动子以提高其驱动基因的表达活性是一个重要的研究方向。本实验初步尝试以增强子序列［3］修饰HPSE启动子，转染肿瘤细胞并分析其活性，为提高HPSE启动子的驱动活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器

人肝癌细胞(HepG2)、喉癌上皮细胞(Hep-2)、人慢性髄原白血病细胞(K-562)均为合肥一力公司产品;质粒pEGFP-HPSEp由皖南医学院附属弋矶山医院中心药理实验室提供，为前期实验构建并保存于－80℃超低温冰箱;含SV40增强子的载体pGL3-Control Vector和阳性对照质粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR为上海生物工程公司产品;PFX、T4 DNA ligase、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ和HindⅢ为 MBI公司产品;PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒均为北京道普公司产品;DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、dNTP、PCR Buffers 均为Takara公司产品;琼脂糖、胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品;10%胎牛血清、Lipofectamine 2000、DMEM培养基和RPIM-1640培养基为Invitrogen公司产品;SV40增强子上、下游引物由中国科学院上海生物工程有限公司合成;大肠杆菌菌株DH5α由安徽医科大学寄生虫学教研室汪学龙教授惠赠;荧光显微镜(Nikon公司产品);流式细胞仪(Beckman公司产品)。

1.2 SV40增强子的引物设计

根据GeneBank中SV40增强子(Accession U47296 pGL3-Control)的核酸序列和PCR引物设计的原则，用Primer5软件，设计SV40增强子的上、下游引物。它们分别是:上游引物Primer1:SV40-F 5'ATATGCgaattcCGA TGGAGCGGAGAATGGG 3'，下游引物 Primer2:SV40-R 5'GCATGTgtcgacGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGG 3'，并在上、下游引物的5'端分别引入限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位点(小写部分为酶切位点，斜体为保护碱基)。

1.3 SV40增强子PCR扩增与纯化

采用50 μl PCR反应体系。以1 μl含SV40增强子的 pGL3-enhancer DNA 为模板，PFX(5 U·μl－1，Invitrogen)聚合酶0.2 μl，上、下游引物(10 μmol·L－1)各 1 μl，dNTPs(10 mmol·L－1)1 μl，10 × PCR Buffer(含Mg2+)为5 μl。冰上加样，离心，置 Techgen PCR 仪。反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，共35个循环;最后68℃延伸10 min。用PCR纯化回收试剂盒将PCR产物分离纯化，操作按试剂盒说明书进行。

1.4 SV40增强子的鉴定和序列分析

制备1%琼脂糖凝胶后，取PCR产物8 μl与10×Loading Buffer 2 μl混匀上样，用 DL Marker 2000 为电泳的标准参照物，90 V×400 mA电泳35 min后，凝胶成像系统下观察并照相。PCR产物连接T载体，将连接产物用CaCl2法制备的感受态细胞DH5α 150 μl涂布LB/Kana平板，37℃倒置培养过夜。次日观察菌落生长情况，平板胶膜封口，4℃保存。挑取阳性菌落PCR电泳鉴定。经鉴定的阳性质粒送上海生物技术公司测序。

1.5 构建重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh

以含有EcoRⅠ和SalⅠ的双酶切体系分别酶切质粒pEGFP-HPSEp及 PCR克隆产物 SV40增强子。30 μl酶切反应体系如下:质粒pEGFP-HPSEp或PCR克隆产物 15 μl，10 × Buffer 3 μl，ddH2O 10 μl，EcoRⅠ和SalⅠ各1 μl。37℃水浴8 h后，经1%琼脂糖凝胶电泳观察分析酶切结果，将酶切产物用胶回收方法回收DNA片段。将胶回收的SV40增强子片段和pEGFP-HPSEp的大片段在T4 DNA连接酶的作用下进行连接。20 μl连接反应体系如下:ddH2O 7.5 μl，PCR 胶回收产物7.5 μl，质粒 pEGFP-HPSEp 双酶切产物 2.5 μl，10 × Buffer 2.0 μl，T4 ligase 0.5 μl。混匀反应体系，4℃连接过夜。连接产物的转化:10 μl连接反应物加120 μl DH5α感受态细胞，冰上30 min;42℃90 s(热休克)，立即冰上1～2 min;加400 μl LB 液体培养基，37℃缓慢(150 r·min－1)振荡45 min;4℃12 000 r·min－1离心 2 min，弃上清，留150 μl涂布 LB/Kana平板;37℃倒置培养过夜。次日，观察菌落生长情况，平板胶膜封口，4℃保存。挑取阳性菌落进行接种，第2天抽提质粒并加以BamHⅠ单酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后送至上海生物有限技术公司进行DNA序列测定。

1.6 重组质粒载体pEGFP-HPSEp-SV40enh的真核表达与功能鉴定

HepG2、Hep2和K562细胞用含10%胎牛血清的RPIM-1640培养液在37℃、5%CO2培养箱饱和湿度条件下培养至70%～80%融合时进行转染。每孔细胞接种3孔，分别转染3种质粒，即 pEGFP-HPSEp-SV40enh、pEGFP-HPSEp 和阳性对照 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR，按照Lipofectamine 2000说明书进行。转染后继续培养48 h，收集悬浮细胞，如有贴壁则用0.2%胰酶消化，用含血清的培养基终止消化。每份样品细胞数为5×105～1×106个。荧光显微镜观察荧光强度;流式细胞仪检测表达EGFP的发光细胞百分比以确定转染效率(转染率比值=pEGFP-HPSEp转染率/pEGFP-HPSEp-SV40enh转染率)。实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 SV40增强子PCR扩增

取PCR反应液8 μl，经1%琼脂糖凝胶电泳后观察发现，在250 bp和500 bp之间出现一特异条带，大小与理论长度261 bp相符，包括酶切位点和保护碱基24 bp(图1)。阳性菌落PCR鉴定SV40增强子电泳图也显示特异条带位于250 bp和500 bp之间(图2)。

图1 PCR产物的电泳图Fig 1 Electrophoretogram of PCR product

图2 阳性菌落PCR产物电泳鉴定Fig 2 Electrophoretogram of positive bacterial colony PCR product

2.2 SV40增强子的测序鉴定

经鉴定的阳性质粒送上海生物技术公司测序，测序结果与GenBank数据库中相应的SV40增强子核酸序列(Accession U47296 pGL3-Control)237 bp比对完全一致，未发现碱基插入、缺失和替换等突变。序列包含了完整的SV40增强子序列。比对一致的序列是46～282 bp(237 bp)。40～45 bp GAATTC是EcoRⅠ酶切位点，283～288 bp GTCGAC是SalⅠ酶切位点(图3)。

2.3 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切

30 μl酶切反应体系中，EcoRⅠ和SalⅠ双酶切SV40增强子、质粒pEGFP-HPSEp，经1%琼脂糖凝胶电泳观察，各片段酶切14 bp，大片段原为4 673 bp，小片段原为261 bp(图4)。

图3 SV40增强子PCR产物测序的部分截图Fig 3 Partial graph of reverse sequencing of pEGFP-HPSEp-SV40 enh

图4 EcoRⅠ和SalⅠ双酶切SV40增强子及pEGFP-HPSEpFig 4 Restriction analysis of SV40 enhancer and pEGFPHPSEp cutted by enzymes EcoRⅠ and SalⅠ

2.4 重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh单酶切鉴定

SV40增强子序列插入到质粒pEGFP-HPSEp指定克隆位点后转化DH5α感受态细胞，涂布LB/Kana平板，挑取阳性菌落进行接种，抽提质粒并加以BamHⅠ单酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳(图5)。

2.5 重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh的测序鉴定

重组质粒经琼脂糖凝胶电泳验证后送至上海生物有限技术公司进行DNA序列测定(反向测序)，经Chromas Lite软件处理后见互补序列中包含完整的237 bp SV40增强子序列，即原图65～301 bp处。59～64 bp处为SalⅠ酶切位点，302～307 bp处为EcoRⅠ酶切位点，309～314 bp处为HindⅢ酶切位点，自315 bp后为原载体中HPSE启动子序列。重组质粒构建是成功的，SV40增强子序列正确的插入到质粒pEGFP-HPSEp中HPSE启动子的下游(图6)。

图5 BamHⅠ单酶切鉴定pEGFP-HPSEp-SV40enhFig 5 Restriction analysis of pEGFP-HPSEp-SV40enh cutted by enzyme BamHⅠ

Chromas Lite软件处理后互补序列:AAGGGCGCTG GGGCTCGGCGGGAGGAAGTGCTAGAGCTCTTGACTCT CCGCTGCGCGGCAGCTGGCGGGGGGAGCAGCCAGGTG AGCCCaagcttCgaattcCGATGGAGCGGAGAATGGGCGGA ACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGG GGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGC TTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT CCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTG CATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCAC ACCCTAACTGACACACATTCCACAGCgtcgacGGTACCG CGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCA AGGGCGAGGAGCGT

图6 重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh中部分片段测序图(反向测序)Fig 6 Partial graph of sequencing of pEGFP-HPSEp-SV40enh

大写字母下划线为插入的SV40增强子序列，gtcgac为SalⅠ酶切位点，gaattc为EcoRⅠ酶切位点，aagctt为HindⅢ酶切位点，HindⅢ酶切位点之前为HPSE启动子序列。

2.6 重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh在人肿瘤细胞中的促转录活性

荧光显微镜观察显示，重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh在人肿瘤细胞株HepG2、Hep2和K562中均表达较强的荧光，与阳性对照质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR转染荧光强度相似，两者镜下无明显差异。而质粒pEGFP-HPSEp转染荧光强度较弱，与前两者相比镜下差异明显(图7)。流式细胞术检测结果显示，质粒pEGFP-HPSEp转染后，发光细胞所占的百分比由 HepG2(3.7%)、Hep2(6.0%)、K562(5.5%)逐渐减小，重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh转染后发光细胞所占的百分比也由 HepG2(4.8%)、Hep2(13.4%)、K562(7.7%)逐渐递减，但均明显高于前者相应细胞株;阳性对照质粒转染各肿瘤细胞株后发光细胞百分比与重组质粒相比差异不明显。两种载体在上述细胞中的转染率比值，即启动子的相对活性比HPSEp/HPSEp-SV40enh 分别为 HepG2 0.77、Hep2 0.45 和 K562 0.71，均小于1。

3 讨 论

肿瘤的复发转移与HPSE密切相关。研究证实，HPSE启动子具有较高而且广谱的肿瘤组织特异性，在人类乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢、胰腺、肝脏、胃、皮肤、膀胱等组织源性的肿瘤及其转移灶中都有高表达活性。HPSE启动子活性的高低还与肿瘤组织的分化、进展密切相关，如随着结肠癌从不典型增生到高分化、低分化，HPSE启动子的活性逐渐增加。该启动子是迄今为止发现的一种比较理想的既有肿瘤特异性又有肿瘤广谱性的潜在肿瘤基因靶向治疗的新工具［4］。前期实验正确克隆了HPSE启动子序列，并成功构建了由该启动子驱动的表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-HPSEp，分别转染肿瘤细胞株和正常细胞株，结果发现，质粒pEGFP-HPSEp只在肿瘤细胞株中表达，也说明HPSE启动子具有肿瘤细胞特异性，但荧光显微镜和流式细胞仪检测结果分析表明，HPSE启动子驱动基因表达的活性还不够强，相比较不如巨细胞病毒启动子的活性［2，5］。

图7 荧光显微镜观察转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA、pEGFP-HPSEp和pEGFP-HPSEp-SV40enh细胞中绿色荧光蛋白表达情况Fig 7 Green fluorescence protein(EGFP)expression of pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA，pEGFP-HPSEp and pEGFP-HPSEp-SV40enh in various kinds of cells

增强子是能使基因转录速率显著提高的一类顺式作用元件，它能通过启动子，提高同一条DNA链上靶基因转录的速率，而且对同源或异源基因同样有效。增强子可在基因的5'上游、基因内或3'下游序列中，甚至远离转录起始点起作用［6］。SV40增强子是最早发现的功能强大的病毒增强子，核心序列由72 bp碱基对重复序列组成。它无明显的细胞种族偏向性，可以提高很多宿主细胞的基因表达水平;在不同的宿主细胞中，它可以增强表达2～20倍。其调控基因转录激活的机制是Z-DNA结构:重复序列中的5'-GCATGCAT-3'顺序，具有嘌呤与嘧啶交替出现的特征，可形成正旋DNA结构，此结构有利于与特定蛋白结合，促进转录。SV40增强子不仅能够增强启动子的转录活性，而且能够促进质粒载体从细胞浆内转移到细胞核中即具有增强DNA的细胞核定位的功能，这种作用是序列特异性的。因此，用SV40增强子构建肿瘤特异性启动子调控转录系统可以从两方面增强治疗基因的表达水平，可以极大提高转染效率。已有以SV40增强子修饰人端粒酶逆转录酶启动子并提高其转录活性的成功实验报道［7-8］。

我们以含SV40增强子的pGL3系列质粒为模版设计引物，上游引物添加EcoRⅠ酶切位点，下游引物添加SalⅠ酶切位点，PCR扩增获得SV40增强子序列。电泳见PCR产物与理论长度261 bp(237 bp加上酶切位点和保护碱基24 bp)一致，初步证明扩增的SV40增强子序列是正确的。克隆SV40增强子的阳性质粒经酶切鉴定和测序，并将测序结果与GenBank数据库Accession U47296中的SV40增强子比较，未发现碱基插入、缺失和替换等突变，与预期结果完全一致，进一步证明本研究成功地扩增了一段长为237 bp的SV40增强子。以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR产物SV40增强子及pEGFP-HPSEp载体，电泳见大片段为4 659 bp，小片段为247 bp(各片段酶切14 bp，大片段原为4 673 bp，小片段原为261 bp)，与预期结果吻合，酶切是成功的。胶回收后以T4 DNA连接酶连接上述两酶切产物，将 SV40增强子序列插入到 pEGFP-HPSEp序列中HPSE启动子的下游构建重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落提取质粒，用BamHⅠ单酶切重组质粒后电泳显示有4.37 kb和624 bp两个片段，与预期吻合，初步证明构建成功。测序结果见完整的SV40增强子片段237 bp成功的插入到pEGFP-HPSEp载体的指定多克隆位点，位于HPSE启动子序列的下游SalⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间，而且整个SV40增强子片段中没有发生碱基插入、缺失和替换等突变，也未影响载体本身的碱基序列。测序结果进一步证明了我们构建的重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh是成功的，符合增强子修饰启动子的构建原则。酶切鉴定后的重组质粒与原质粒pEGFP-HPSEp及阳性对照质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR用脂质体2000分别转染 HepG2、Hep2和K562细胞，荧光显微镜下观察发现pEGFPHPSEp-SV40enh在人肿瘤细胞株HepG2、Hep-2和K-562中均表达较强的荧光，与阳性对照质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR转染荧光强度相似，两者镜下无明显差异。而原质粒pEGFP-HPSEp转染荧光强度较弱，与前两者相比镜下差异明显。观察结果初步说明了重组质粒在上述肿瘤细胞中的表达活性明显比原质粒高，也即以SV40增强子修饰后HPSE启动子(驱动荧光蛋白表达)的活性能得到增强。

总之，本研究扩增了完整的SV40增强子序列，并按照实验要求成功的构建了重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh，转染人肿瘤细胞以分析其活性，初步探索了以增强子序列修饰提高HPSE启动子活性的途径，为今后更好地利用肿瘤特异性启动子靶向杀伤肿瘤奠定实验基础［5，9］。

［1］杨玉捷，张亚历.乙酰肝素酶——癌细胞浸润、转移的一个关键酶［J］.肿瘤，2004，24(1):82-83.

［2］胡良鹤，陈晓鹏.人乙酰肝素酶核心启动子的扩增及序列分析［J］.皖南医学院学报，2009，28(5):319-322.

［3］LI H S，LIU Y，LI D F，et al.Enhancement of DNA vaccineinduced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer［J］.Chin Med J，2007，120(6):496-502.

［4］栾琪，孙静，高天文.乙酰肝素酶在恶性肿瘤的表达调控研究进展［J］.肿瘤学杂志，2008，14(10):856-859.

［5］陈晓鹏，胡良鹤，王永.人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体的构建和功能分析［J］.上海交通大学学报:医学版，2010，30(3):176-178.

［6］王丽娜，李卓，薛志刚，等.用原核增强子提高hTERT启动子介导的基因表达［J］.中华肿瘤防治杂志，2006，13(15):1125-1130.

［7］石秦东，张蓬勃，康前雁，等.以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定［J］.南方医科大学学报，2007，27(12):1834-1837.

［8］张维铭，薛丽英，徐垚，等.SV40增强子修饰提高人端粒酶逆转录酶启动子的转录活性［J］.中华病理学杂志，2006，35(11):691-693.

［9］王永，陈晓鹏.肿瘤特异性启动子驱动的RNA干扰与肿瘤基因靶向治疗［J］.国际肿瘤学杂志，2009，36(12):894-896.