人结直肠癌耐药细胞株HT-29/CPT-11的构建及其生物学特性探讨

冯婉婷，车晓玲，李进，宗明珠，史玉叶，曹维克，何敬东

(1.南京医科大学，江苏南京 210029;2.南京医科大学附属淮安第一人民医院 肿瘤内科，江苏淮安 223300)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道最常见恶性肿瘤之一，占所有恶性肿瘤的10% ～15%［1］。伊立替康(CPT-11)作为拓扑异构酶抑制剂家族成员之一，可抑制DNA单链断裂后修复，干扰DNA复制和转录，导致肿瘤细胞死亡［2］，现已广泛应用于转移性CRC的治疗［3］，无论是用于一线治疗，还是在氟尿嘧啶治疗失败后的二线治疗，CPT-11均显示了其抗肿瘤的活性。然而化疗药物引起的耐药是制约其疗效的重要因素之一，因此，不断提高患者化疗敏感性是临床化疗亟需解决的重要课题。目前，有关预测CPT-11耐药性的相关分子标志物的研究相对较少，主要集中在药物代谢过程中参与的酶、转运蛋白以及作用靶点蛋白的基因。人结肠癌耐药细胞株的建立可为研究肿瘤耐药机制、逆转CRC耐药提供实验基础。因此，本研究将采用逐步提高培养基中CPT-11浓度的方法，间歇诱导CRC细胞耐药，并对亲本细胞与耐药细胞进行比较，初步探讨其生物学特性及其耐药机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人源性结直肠癌细胞株HT-29购自中国科学院上海生命科学研究所。

1.1.2 试剂与载体 CPT-11(Sigma公司)，细胞周期检测试剂盒(Beckman公司)，RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)，逆转录及扩增试剂盒(Biouniquer公司)，CCK-8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学研究所)，1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及耐药细胞的建立 将人结直肠癌细胞株HT-29置于含有10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素和100 μg·ml－1链霉素的 1640 培养基，置 37 ℃、5%CO2孵箱中培养。采用逐步提高培养基中CPT-11浓度的方法，间歇诱导肿瘤细胞耐药。CPT-11浓度从4 μg·ml－1开始，加药 48 h 后换液撤药，3 ～4 d 换液1次，待细胞重新长至对数生长期时再次加相同浓度药物进行诱导，如此重复再增加药物浓度，连续培养10 个月，获得能在 60 μg·ml－1浓度中稳定生长的人结直肠癌耐药细胞株，并命名为HT-29/CPT-11。

1.2.2 CCK-8法检测细胞药敏性 取对数生长期的亲本细胞HT-29和耐药细胞HT-29/CPT-11，胰酶消化后，按每孔100 μl含2×104个细胞接种于96孔板上，培养24 h后分别加入药物浓度分别为20、40、80、160、240、320 μg·ml－1的 CPT-11，设置 6 个复孔，培养48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，继续培养2 h后，用全自动酶标仪在450 nm处测定OD值。计算药物CPT-11分别对HT-29、HT-29/CPT-11的半数抑制率(IC50)。

细胞抑制率(%)=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

耐药指数(resistance index，RI)=子代细胞IC50/亲代细胞IC50。

IC50采用改良寇氏法计算:Ig(IC50)=Xm－I(P－(3－Pm－Pn)/4)(Xm:Ig最大剂量，I:Ig最大剂量/相临剂量，P:阳性反应率之和，Pm:最大阳性反应率，Pn:最小阳性反应率)

1.2.3 测定细胞生长曲线及倍增时间 将对数生长期的HT-29和HT-29/CPT-11细胞，以浓度为2×104ml－1分别接种在96孔板，间隔24 h分别取3个复孔，计数每孔活细胞数量，连续计数8 d，按每天计数细胞数量绘制细胞生长曲线。计算细胞的倍增时间公式:TD=t×log 2/(logNt－logNo)(其中TD:群体倍增时间，t:培养时间，N0、Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数)。

1.2.4 流式细胞术(FCM)检测细胞周期 收集处于对数生长期的HT-29和HT-29/CPT-11细胞，每组细胞数约1 ×106个，以1 500 r·min－1离心 5 min，PBS 洗2遍，预冷70%乙醇固定，再用PBS洗2遍，弃上清，在细胞沉淀中加入0.1%RNA酶A溶液150 μl重悬细胞，4 ℃ 孵育 30 min，再加入 0.1%PI染液 150 μl混匀，4℃避光孵育10 min，将细胞悬液混匀，用200目尼龙膜滤过到流式管中，加入1 ml PBS用FCM进行细胞周期分析，重复实验3次。

1.2.5 RT-PCR半定量测定MDR-1 mRNA的表达分别收集处于对数生长期的HT-29和HT-29/CPT-11细胞，TRIzol一步法提取总RNA，按逆转录试剂盒说明操作(反应体系20 μl)，合成第一链cDNA，扩增如试剂盒说明(反应体系25 μl)。引物序列:MDR-1上游引物5'-TCGTAGGAGTATCCGTGGAT-3'，下游引物5'-CATTGGGCGAGCCTGGTAG-3';内参β-actin上游引物 5'-GCCTGGAAGTGAAGTTGTGGACTCCCG-3'，下游引物 5'-CCAGCGTGAGTACTGCTGCGGCTCAG-3'。PCR循环条件:95℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58.3℃ 30 s，72 ℃1 min，36个循环;72℃ 5 min。以β-actin作为内参，1%琼脂糖凝胶100 V等压电泳观察实验结果，凝胶成像仪扫描，以目的基因与β-actin光密度积分值之比作为其相对表达量(Image J)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 细胞形态学观察

光镜下观察，发现亲本细胞株HT-29呈圆形或椭圆形，细胞镶嵌排列成铺路石样且成团生长(图1)。耐药细胞株HT-29/CPT-11比亲本HT-29细胞体积明显增大，形态也发生变化，排列紊乱无规律，细胞生长弥散。

图1 光镜观察细胞形态 ×10Fig 1 Light microscopy observation of cell morphology×10

2.2 药物敏感性试验

CCK-8检测结果显示，CPT-11对HT-29和HT-29/CPT-11 细胞的 IC50分别为(40.59 ± 3.29)μg·ml－1和(264.43 ± 8.98)μg·ml－1，耐药指数为 6.51(图2)。提示HT-29/CPT-11细胞对CPT-11有明显的耐药性(P＜0.05)。

图2 CPT-11对HT-29或HT-29/CPT-11的IC50Fig 2 IC50of CPT-11 in HT-29 or HT-29/CPT-11 cell lines

2.3 细胞生长曲线和群体倍增时间

细胞生长曲线(图3)显示，两种细胞在6～7 d达到对数生长期，耐药细胞株HT-29/CPT-11较HT-29群体倍增时间稍延长，分别为(41.29±1.69)h和(27.12 ±2.73)h，生长增殖速度减慢，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 细胞生长曲线Fig 3 Growth curve of two cell lines

2.4 耐药细胞株细胞周期的变化

见表1。

表1 HT-29和HT-29/CPT-11细胞周期比较(±s)Tab 1 Comparison of cell cycle between HT-29 and HT-29/CPT-11(±s)

表1 HT-29和HT-29/CPT-11细胞周期比较(±s)Tab 1 Comparison of cell cycle between HT-29 and HT-29/CPT-11(±s)

与 HT-29细胞比，a P ＜0.05

细胞株 G0/G1期 S期 G2/M期HT-2949.8 ±1.83 40.5 ±1.4 9.7 ±1.25 HT-29/CPT-11 60.2 ±2.71a 27.1 ±2.3a 12.7 ±1.8

由表1可见，与亲本细胞相比，HT-29/CPT-11耐药细胞的细胞周期分布发生明显改变，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 RT-PCR检测MDR-1 mRNA表达

见图4。

图4 HT-29和HT-29/CPT-11细胞MDR-1 mRNA的表达Fig 4 The expression level of MDR-1 mRNA in HT-29 and HT-29/CPT-11 cell lines

Image J图像分析结果显示，HT-29/CPT-11、HT-29两株细胞MDR-1/β-actin的光密度积分值之比分别为1.086 ±0.054 和 0.416 ±0.02(P＜0.05)，HT-29/CPT-11耐药细胞MDR-1表达明显高于亲本细胞株HT-29，说明在CPT-11的长期刺激下可以诱导耐药细胞MDR-1基因表达增强。

3 讨 论

细胞耐药既是正常细胞维持自身稳定的防御机制之一，也是引起肿瘤化疗失败及肿瘤复发的主要原因之一。肿瘤细胞耐药机制十分复杂，迄今为止，体外诱导耐药细胞株仍是研究细胞分子生物学变化及肿瘤耐药机制的基础。

近年来，国内外相继建立了胃癌、乳腺癌、卵巢癌等耐药细胞模型。我们采用逐步提高培养基中CPT-11浓度的方法，间歇诱导CRC耐药细胞株，历经10月余，成功建立并鉴定了人结直肠癌CPT-11耐药细胞株HT-29/CPT-11。其对 CPT-11耐药指数为6.51。且耐药细胞株HT-29/CPT-11细胞形态异型性明显增加。除此之外，细胞倍增时间显著延长。目前认为，肿瘤细胞倍增时间越短，对化疗药物越敏感，疗效越好;反之，对化疗药物的敏感性降低。流式结果显示G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，说明细胞在耐药之后其增殖受到明显抑制，DNA复制时间延长。

肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)机制是一个复杂的生物学过程，影响因素和参与机制众多。目前，关于肿瘤耐药机制的研究主要集中以下几点:(1)转运蛋白引起的耐药，包括有肿瘤MDR基因［4］编码产物的P-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)的高表达、MDR相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)基因及其产物的表达［5］。(2)GSH 依赖性解毒酶系统的改变［6］，谷胱甘肽 S转移酶(ghtathione S-transferase，GST)参与化疗药物的解毒，降低抗肿瘤药物的细胞毒作用，从而产生耐药。(3)当DNA损伤修复时，参与修复的相关酶，包括核酸内切酶和DNA连接酶等数种酶活性增强。细胞修复损伤的能力和MDR产生密切相关［7］。(4)细胞外低pH值、细胞质内高pH值的特点，不仅可造成化学治疗药物被隔离在酸性区内，还能上调P-gp表达和活性，结果使化学治疗药物无法到达细胞内靶点发挥作用，导致肿瘤对化疗药物耐药［8］。

细胞内药物蓄积减少是最先发现的、也是最常见的导致肿瘤耐药的原因之一。有研究［5-9］显示，参与药酶代谢的ABC转运蛋白家族可以减少细胞之间药物的蓄积，从而使得细胞对喜树碱类药物耐药。膜转运蛋白中P-gp、MRP2和BCRP是参与CPT-11代谢最重要的转运蛋白。耐药细胞表面P-gp的发现使人们认识到药物泵对药物的主动外排是细胞内药物蓄积减少的主要原因［5］。MDR-1基因的过度表达是产生多药耐药的主要机制，这一观点已得到公认［4］。MDR-1基因编码跨膜糖蛋白P-gp，P-gp具有“药泵功能”，是一种ATP依赖性药泵，通过分解ATP提供能量，将药物转运到细胞外，使细胞内药物浓度维持较低水平，从而产生耐药。肿瘤细胞在长期的化疗药物的刺激下，耐药基因及其编码蛋白表达的改变可以进一步证实细胞株的耐药性。因此，本实验将MDR-1基因作为研究对象，采用RT-PCR技术检测耐药细胞株耐药细胞株HT-29/CPT-11和亲本细胞株HT-29中MDR-1基因的表达水平，发现耐药细胞株MDR-1基因表达明显增加(1.086 ±0.054vs0.416 ±0.02，P＜0.05)，这说明在CPT-11的长期刺激下可以诱导耐药细胞MDR-1基因表达增强，提示MDR-1基因的高表达可能是造成HT-29/CPT-11细胞内CPT-11药物蓄积减少，从而成为耐药发生的可能机制之一。当然除了细胞MDR-1基因参与之外，还有其他途径参与，有待进一步研究。

总之，本研究结果表明，我们利用药物浓度递增间歇诱导出的人结直肠癌CPT-11耐药细胞株在细胞形态、细胞周期、生长速度上以及药物敏感性等方面发生了明显的变化，符合耐药细胞的特征。在下一步研究中，我们将利用耐药细胞株HT-29/CPT-11进行耐药机制以及耐药逆转方面的研究。

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