乌司他丁对重症急性胰腺炎患者早期外周血单核细胞Toll样受体4表达的影响

卫文俊，陶霖玉，李蓉，陈玲，王玉蓉，曾凤好

(广东医学院附属深圳南山医院普外科，广东深圳 518052)

重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是一类起病急、病情复杂、治疗棘手的临床常见急腹症，其病情的演变及加重与继发的局部和全身炎症介质的过度释放、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory syndrome，SRIS)有关。乌司他丁(ulinastatin)是从人尿液中分离、纯化的尿胰蛋白酶抑制剂。动物实验表明，乌司他丁对急性胰腺炎具有明显的抗炎治疗效果;部分临床研究也提示其具有控制病情、缓解症状的作用。但关于其作用机制仍未完全明了，并存在争议［1-2］。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)属于一种病原微生物模式识别受体，作为脂多糖的跨膜受体，是炎症反应的门户蛋白，在免疫防御反应中起着十分重要的作用［3］。乌司他丁对急性胰腺炎引起的全身炎症反应的拮抗及抑制作用是否与抑制单核细胞表面Toll样受体4的表达有关，目前尚不明确。本研究旨在观察乌司他丁对重症急性胰腺炎患者外周血单核细胞Toll样受体4表达的影响，探讨乌司他丁治疗重症急性胰腺炎的作用靶点及抑制炎症反应的作用机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

根据中华医学会外科学会急性胰腺炎的临床诊断及分级标准(1996年第2次方案)，选择2008年6月至2011年6月在我院住院的重症急性胰腺炎患者58例，其中男31例，女27例，年龄28～62岁，平均(38±6)岁，随机分为乌司他丁组(29例，予以常规治疗+乌司他丁)、常规组(29例，予以常规治疗)。另外，选择20例健康志愿者作为对照组，其中男11例，女9例，年龄26～60岁，平均(35±5)岁。3组间性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 主要试剂和仪器

流式细胞仪CYTOMICS FC 500购自Beckman公司，藻红蛋白(PE)标记的抗人TLR4单克隆抗体购自eBioscience公司(美国)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人CD14单克隆抗体购自Beckman Coulter公司，TNF-α、IL-6 检测试剂盒(Quantikine EL ISA Kit，R ＆D Systems)购自Minneapolis公司。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 (1)常规组:予以禁食、胃肠减压、抑制胰酶活性、纠正水电解质平衡、抢救休克、预防感染及营养支持等治疗。(2)乌司他丁组:在常规治疗的基础上，予乌司他丁10万U溶于5%葡萄糖注射液500 ml，静脉滴注，每天2次，每次2 h滴完，3 d后改为10万U，每天1次，疗程7～14 d。

1.3.2 标本的采集和处理 用无热源的EDTA K2抗凝的无菌真空采集管采集SAP患者入院第1天治疗前，入院后第3、5、7、14天的静脉血各 15 ml。对照组仅采血1次。血标本均在30 min内处理:4℃离心5 min后，提取0.5 ml血浆，置冰箱－70℃冻存用于检测细胞因子。

1.3.3 TLR4、CD14检测 血标本于12 h内进行直接免疫荧光标记单核细胞表面CD 14和TLR 4，以流式细胞仪检测CD 14和TLR 4表达。方法为100 μl全血 +5 μl TLR4-PE+10 μl CD14-FITC，避 光 孵 育20 min，加入 Optilyse C溶血素(Beckman Coulter公司)500 μl，溶血 10 min，1 500 × g 离心 5 min，加入2 ml PBS混匀，1 500 ×g离心 5 min，加入 500 μl PBS后上机检测，以CD14圈门，检测门内细胞PE的平均荧光强度，用Mouse IgG2a作为同型对照。

1.3.4 血浆 TNF-α、IL-6的检测 以 ELISA试剂盒检测血浆TNF-α、IL-6水平，操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 3 组 TLR4、CD14 的表达

见表1。

表1 3组外周血单核细胞表面TLR4的表达变化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

表1 3组外周血单核细胞表面TLR4的表达变化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

与对照组比较，a P ＜0.01，b P ＜0.05;与常规组比较，c P ＜0.05

组 别 n入院时间/d 1 3 5 7 14对照组20 5.01 ±1.21 － － － －常规组 29 11.86 ±2.59a 10.25 ±2.24b 8.65 ±2.89b 6.28 ±2.32b 5.10 ±2.74乌司他丁组 29 12.20 ±2.26a 8.02 ±2.45bc 6.21 ±3.21bc 5.05 ±2.36c 4.95 ±2.33

由表1可见，与对照组比较，在入院第1天常规组和乌司他丁组患者外周血单核细胞TLR4表达明显增高(均P＜0.01)，在入院治疗后第3、5天 TLR4表达逐渐降低，但仍高于对照组(均P＜0.05)。乌司他丁组在入院后第7天TLR4表达与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，入院后第14天两组TLR4表达均基本恢复正常。乌司他丁组与常规组在入院第1天治疗前，外周血单核细胞TLR4表达差异无统计学意义(P＞0.05)，而在治疗后第 3、5、7 天乌司他丁组外周血单核细胞TLR4的表达均明显低于常规组(P＜0.05)。CD14的表达在3组间差异无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

表2 各组外周血单核细胞CD14的表达变化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

表2 各组外周血单核细胞CD14的表达变化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

组 别 n入院时间/d 1 3 5 7 14对照组20 17.35 ±4.21 － － － －常规组 29 17.88 ±4.86 17.52 ±3.96 17.42 ±3.94 16.98 ±4.28 17.11 ±4.08乌司他丁组 29 17.69 ±5.20 17.54 ±5.36 17.29 ±4.57 17.19 ±4.12 17.23 ±5.14

2.2 3 组 TNF-α、IL-6 浓度的检测

常规组和乌司他丁组入院第1天外周血TNF-α、IL-6的浓度均明显高于对照组(P＜0.01)，入院治疗后第3、5、7天逐渐降低，但仍较对照组增高(P＜0.05);乌司他丁组在治疗后第3、5、7天，外周血TNF-α、IL-6的浓度与常规组对应时点比较均明显降低(P＜0.05，见表3、4)。

表3 各组血浆中TNF-α浓度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

表3 各组血浆中TNF-α浓度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

与对照组比较，a P ＜0.01，b P ＜0.05;与常规组比较，c P ＜0.05

组 别 n入院时间/d 1 3 5 7 14对照组20 12.52 ±2.03 － － － －常规组 29 32.65 ±5.26a 29.87 ±4.96b 24.64 ±5.94b 20.57 ±4.38b 13.36 ±4.26乌司他丁组 29 33.15 ±6.12a 24.25 ±5.18bc 19.75 ±4.65bc 14.69 ±4.85bc 12.23 ±5.24

表4 各组血浆中IL-6浓度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

表4 各组血浆中IL-6浓度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

与对照组比较，a P ＜0.01，b P ＜0.05;与常规组比较，c P ＜0.05

组 别 n入院时间/d 1 3 5 7 14对照组20 17.58 ±4.65 － － － －常规组 29 32.65 ±5.01a 28.77 ±4.85b 26.64 ±5.88b 21.57 ±4.12b 17.36 ±4.09乌司他丁组 29 31.21 ±6.25a 25.65 ±5.84bc 21.75 ±4.45bc 18.69 ±4.61bc 16.89 ±5.61

2.3 SAP外周血单核细胞 TLR4的表达与血浆TNF-α、IL-6 浓度的相关性

Pearson相关分析表明，常规组与乌司他丁组组内对应各时间点，SAP患者外周血单核细胞TLR4表达水平与血浆TNF-α的浓度变化一致，二者具有正相关性(r=0.953，P＜0.05);血浆 IL-6 浓度的变化在各组内对应时间点与TLR4表达的变化亦具有正相关性(r=0.902，P＜0.5)。

3 讨 论

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是近年来被认识的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)的受体，且被认为是炎症瀑链式反应的闸门。TLRs属于Ⅰ类跨膜受体，其胞外结构域负责刺激信号识别，而胞内则是称为Toll/IL-1R(TIR)的结构域，与信号的传导相关。TLRs广泛分布于单核巨噬细胞系统、内皮细胞和树突细胞等［4］，其配体包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。现已在人体和小鼠体内发现13种TLR，分别命名为 TLR1～TLR13。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是第一个被发现的Toll样受体，作为脂多糖(LPS)受体，介导LPS或内毒素引起的胞内信号传递，其激活将引起一系列下游分子的活化，最后激活通用转录因子NF-κB，最终引起以TNF-a等为中心的前炎症因子激活，导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应［5］，因此，它可能作为急性炎症反应损伤的扳机点启动机体的这种病理过程。有研究［6］表明，TLR4在急性胰腺炎触发急性炎症反应的过程中具有重要作用，并与多器官功能障碍和肠源性感染的发生密切相关。因此，以TLR4为靶点控制这种瀑链式炎症反应的有序性，可能是解决类似临床问题的新方向［7］。

乌司他丁(ulinastatin)为一种糖蛋白，含有143个氨基酸，分子量约67 kD，是一种典型的Kuniz型的蛋白酶抑制剂，具有两个活性功能区，两个活性功能区均有很广的抑酶谱，能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性，同时乌司他丁不但对中性粒细胞蛋白酶具有较强的抑制作用，而且还能抑制白细胞释放炎性介质，其机制可能是通过阻断蛋白酶所介导的中性细胞聚集，从而减轻了炎性介质与氧自由基的释放，有效制约了酶、细胞因子、氧自由基级联反应所形成的炎症放大效应［8］。乌司他丁用于重症急性胰腺炎的治疗，可改善临床症状、提高治疗效果，但其作用是否与抑制TLR4有关尚不明了。

本研究结果显示，与对照组相比较，重症急性胰腺炎早期，外周血单核细胞TLR4表达明显增高，随后逐渐下降，至7 d左右恢复正常;血中TNF-α、IL-6浓度与TLR4变化一致。表明SAP早期可能通过先天性免疫门户蛋白TLR4激活单核巨噬细胞系统NF-κB等下游信号因子，导致TNF-α等促炎细胞因子的产生和释放。乌司他丁组在常规治疗的基础上，在发病早期即应用乌司他丁治疗，结果在治疗后第3天始，外周血单核细胞TLR4的表达均比相应常规组明显降低，在各对应时点TNF-α、IL-6浓度下降的更快，并且恢复时间也明显缩短，由此推测，乌司他丁可能对外周血单核细胞表面TLR4的表达有抑制作用，其对重症急性胰腺炎引起的全身炎症反应的拮抗作用可能与其对TLR4表达的抑制进而减少TNF-α、IL-6等炎症因子有关。

综上所述，重症急性胰腺炎早期引起的全身炎症反应与外周血单核细胞表面TLR4的表达异常有关，乌司他丁可能通过影响TLR4的表达起到抑制炎症反应进而改善预后的作用，但其与TLR4具体的作用机制和相互关系仍需进一步研究。

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