乳酸菌IIa类细菌素抗菌机制的研究

饲用微生物工程国家重点实验室 胡小媛 王安如＊

大北农科技集团

福建师范大学生命科学学院 黄建忠＊

农业部饲料生物技术重点开放实验室 滕 达 王建华＊

中国农业科学院饲料研究所

细菌素是由某些细菌染色体或质粒编码、核糖体合成、具有抗菌活性的多肽或蛋白质（Deegan等，2006），主要作用于与产生菌亲缘关系近的菌株（Gautam和Sharma，2009）。迄今已有许多细菌素得到分离和鉴定，以乳酸菌产生的细菌素居多，在细菌素数据库中，乳酸菌细菌素约占65%。据统计，已有129种乳酸菌细菌素被报道，其中IIa类39种，约占30%。IIa类细菌素除了二硫键形成之外无其他翻译后修饰，相对于其他细菌素具较简单结构，因此被广泛用于异源表达研究，并相继在乳酸菌、大肠杆菌、酵母等系统中得到成功表达（Lohans和Vederas，2012）。本文从细胞及分子水平上归纳总结了乳酸菌IIa类细菌素的抗菌机制及其在动物消化道中的抗菌作用研究进展。

1 乳酸菌IIa类细菌素的理化特性与生物学功能

根据基本结构及性质，可将乳酸菌细菌素分为三大类（表1），其中IIa类乳酸菌细菌素是数量最多且研究比较广泛及深入的一类。IIa类细菌素成熟肽多含37～48个氨基酸，其肽链大致分为两个区域：带正电荷、高保守的亲水性N端，低保守的两亲性或疏水性C端。在高保守区N端含1个“片球菌素盒”即YGNGV/L共有序列，两个半胱氨酸形成一个二硫键（Nes等，2007）。有些细菌素C端也有1个二硫键，如pediocin PA-1/AcH、divercin V41、enterocin A 等。 核磁共振（NMR）分析 5种 IIa类细菌素 leucocin A、carnobacteriocin B2、curvacin A、sakacin P及 sakacin P 突变体的结构显示，N端形成β片层结构，由一个保守二硫键稳定其结构（Fimland等，2005）。C端为两亲性α螺旋，延伸的C末端形成发夹样结构，含2个二硫键的IIa类细菌素则依靠C端二硫键稳定此发夹结构（Drider等，2006）。

IIa类细菌素具高等电点，pI为8～10；对热稳定，如plantaricin 423经100℃、60 min仍保持50%活性；对酸碱耐受性强，在pH 2～11仍保持大部分活性；对胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k等敏感，对α-淀粉酶和脂肪酶不敏感（Herranz等，2001a；Reenen 等，1998）。 除了对产生菌亲缘关系近的细菌及李斯特氏菌有抑制作用外，有些宽抑菌谱细菌素，如enterocin P、pediocin PA-1等也可抑制亲缘关系较远的革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等（Gautam 和 Sharma，2009；Cintas等，1997）。

表1 乳酸菌细菌素的分类

2 IIa类细菌素作用机制

2.1 细胞水平 IIa类细菌素主要通过破坏靶细胞膜稳定性导致胞内K＋、磷酸盐、氨基酸、ATP及其他小分子物质外泄，细胞质子动力（△ψ-跨膜电势和△pH-pH梯度）下降或崩溃，ATP耗竭，从而杀死细胞（Kjos等，2009；赵爱珍，2004）。研究报道，mesentericin Y105（600AU）可使单增李斯特氏菌膜电位在10 min内降低45%，还能抑制亮氨酸和谷氨酸转运，使氨基酸在细胞内累积之前排出胞外（Maftah等，1993）。bavaricin MN以浓度依赖方式快速降低单增李斯特氏菌膜电位，浓度达9.0 μg/mL时靶细胞膜电位下降 85%（Kaiser和Montville，1996）。 另有报道，enterocin P 尽管不影响屎肠球菌Enterococcus faecium T136的跨膜pH梯度，但能降低跨膜电位，在靶细胞质膜上形成特定K+通道导致K+外流，引起靶细胞死亡（Herranz等，2001b）。

带正电荷的亲水性N端β片层结构通过静电作用先与靶细胞膜上阴离子磷脂头部极性残基结合（Deegan 等，2006；Kazazic 等，2002），然后疏水性C端与膜脂酰基链作用插入到细胞膜疏水区，进而形成跨膜螺旋结构，介导细胞内各种物质及能量泄漏，引起细胞死亡（Chen等，1997；Fimland等，1996）。C端是细菌素靶细胞特异性的关键决定区（Todorov，2009）。细菌素C端定点突变后，靶细胞特异性发生改变，早期有研究者将不同细菌素的N端和C端进行杂交得到新细菌素，其靶细胞特异性类似于C端来源的母体细菌素（Fimland 等，2005；Fimland 等，1996）。 这些证据均表明，C端为IIa类细菌素靶细胞特异性的决定区。

2.2 分子水平 大多数IIa类细菌素杀菌作用具特异性，缘于细菌素C-端的特异性决定区与靶细胞膜表面特异受体相互作用（Kjos等，2011）。来源于pediocin PA-1 C端的15肽抑制细菌素pediocin PA-1对靶细胞的作用，而对其他细菌素无抑制作用或抑制程度较轻。研究认为，是由于15肽与细菌素pediocin PA-1竞争结合靶细胞膜中的受体的原因（Fimland等，1998）。有研究报道，IIa类细菌素是以靶细胞膜中的甘露糖透性酶EIItMan为受体，该受体属磷酸转移酶系统PTS，在一些细菌中主要负责糖的运输和磷酸化（Stoll和Goebel，2010；Drider等，2006）。 甘露糖磷酸转移酶系统Man-PTS中的 EIItMan由 IIA、IIB、IIC及 IID 四个结构域组成，形成2～4个亚基，如单增李斯特氏菌的EIItMan由3个亚基组成（IIA和IIB融合成一个亚基），由mptACD操纵子编码，其中IIA和IIB位于细胞质，参与磷酸化；IIC和IID位于膜上，参与甘露糖转运 （Kjos等，2011；Tessema 等，2011）。有研究表明，在单增李斯特氏菌和粪肠球菌中，编码EIItMan的mpt操纵子定向变异会导致细菌对细菌素失去敏感性 （Dalet等，2001；Hechard等，2001）。mpt操纵子的转录由rpoN基因编码的σ54因子控制，该因子可选择性识别启动子序列，负责特定基因的转录（Drider等，2006）。15年前有人构建单增李斯特氏菌转座子突变体，发现rpoN基因缺失突变体对mesentericin Y105失去敏感性，突变体重获rpoN基因后又恢复了敏感特性，类似现象在其他细菌如粪肠球菌中也存在 （Dalet等，2000；Robichon 等，1997）。 另外，甘油磷酰二酯磷酸二酯酶（GlpQ）、磷酸二酯酶（PDE）基因表达也会影响细菌对IIa类细菌素的敏感性，分别缺失rpoN、GlpQ及PDE基因的粪肠球菌JH2-2突变体均对IIa类细菌素divercin V41的敏感性降低，降低程度为：缺rpoN突变体>缺glpQ突变体>缺PDE 突变体（Calvez等，2007）。

Ramnath等（2004）将单增李斯特氏菌（Listeria.monocytogenes）的mptACD操纵子转入对IIa类细菌素不敏感的乳酸乳球菌Lactococcus lactis中表达，发现重组菌株对各IIa类细菌素均敏感，且不同菌株mpt表达差异影响重组子对细菌素的敏感程度 （Kjos等，2009）。 说明，EIItMan确实作为IIa类细菌素受体在特异性和敏感性中起作用。在细菌素产生菌中，同源免疫蛋白以细菌素依赖方式结合在此受体上，防止自杀 （Diep等，2007）。EIItMan的IIC和IID位于膜上，可能是真正的受体结构域。L.monocytogenes的mptACD操纵子的每个基因分别在L.lactis中表达，结果显示，只单独表达mptC就足以使重组菌对IIa类细菌素敏感，进而说明IIC是IIa类细菌素在靶细胞膜上的特异受体（Ramnath，2004）。 Kjos等（2010）用敏感 L.monocytogenes的甘露糖磷酸转移酶基因mpt和非敏感性L.lactis的甘露糖磷酸转移酶基因ptn设计了一系列Man-PTS嵌合体和突变体，结果也显示IIC是IIa类细菌素作用于靶细胞的特异受体。

但并非所有细菌的甘露糖透性酶均可以作为IIa类细菌素受体。Kjos等（2009）对大量细菌的甘露糖磷酸转移酶系统Man-PTS进行了遗传进化分析，将其分为三大类，只有第一类可作为IIa细菌素的作用受体，三个序列α、β、γ区域将第一类与其他两类区别开来（Kjos等，2009）。另外，Man-PTS表达水平并不是决定细菌是否对细菌素敏感的唯一因素，有些对细菌素不敏感的细菌中Man-PTS表达水平与敏感菌相当，其确切机制尚无定论（Kjos等，2011）。有试验表明，细菌细胞膜组分，如脂质、丙氨酸含量及靶细胞膜表面电荷等也是影响其细菌素敏感性的因子 （Kjos等，2011；Vadyvaloo，2004）。由于IIa类细菌素作用于靶细胞的第一步是由其带正电荷的N端与靶细胞膜阴离子磷脂头部极性残基结合，所以靶膜脂质组成、电荷改变等理当会影响细菌素对靶细胞膜的亲和力，从而影响细菌素活性。

3 IIa类细菌素及其产生菌在动物消化道内的作用

抗生素长期和广泛使用导致大量病原菌产生不同程度耐药性，严重威胁人畜健康。开发能有效抑制病原菌、对益生菌无害、无残留，且不产生耐药性的新型抗生物质迫在眉睫。

目前，细菌素作为饲料添加剂的研究报道很少，近年有关细菌素产生菌在动物体内抑制病原菌的报道较多，如用IIa类细菌素enterocin A产生菌E.faecium EK13饲喂感染Salmonella dusseldorf SA31的日本鹌鹑及感染Escherichia coli的猪仔，减少了日本鹌鹑盲肠和粪便中S.dusseldorf SA31数量，降低了猪仔粪便中E.coli数量（Strompfová 等，2006；Lauková 等，2003）。 给肠道已定植耐万古霉素肠球菌的小鼠每天口服IIa类细菌素pediocin PA-1产生菌片肠球菌MM33，3 d后耐药菌浓度比对照组减少78 CFU/g，对照组无明显变化，其机制有待进一步探讨（Millette等，2008）。此外，利用IIa类细菌素作为体内治疗药物控制细菌感染研究正成为一个迅速发展的领域（Lohans和 Vederas，2012）。 用小鼠模型研究细菌素在体内对L.monocytogenes的抑制效果，给感染L.monocytogenes的小鼠口服 250 μg/d纯细菌素pediocin PA-1，肠道目标菌菌数在第3、6天及9天分别比对照组减少10、251CFU和25 CFU，第3天时肝脏和脾脏目标菌菌数分别减少159 CFU和1259 CFU，第6天肝脏和脾脏中已无目标菌检出，且不影响小鼠采食量、体重以及肠道正常菌群；另一处理是给感染L.monocytogenes小鼠静脉注射 2 μg的divercinV41，目标菌数比对照组减少2.0×105CFU，而先注射divercin V41后感染目标菌的小鼠，其目标菌数减少1.3×103CFU（Dabour等，2009；Rihakova 等，2009）。IIa 类细菌素对胃蛋白酶、胰蛋白酶等敏感，因此其应用范围和效果受到 限 制 （Lohans 和 Vederas，2012）。Kheadr 等（2010）在模拟胃肠道环境加入纯细菌素pediocin PA-1，处理90 min后，该细菌素仍保持部分活性，到十二指肠才完全失活。胃肠复杂环境及丰富的酶不利于细菌素到达靶位点发挥作用，采用特殊材料包被细菌素被认为是解决此问题的有效途径之一（Kheadr等，2010；Colas等，2007）。

4 结语

IIa类细菌素大多由乳酸菌产生，少数IIa类细菌素由芽孢杆菌产生 （如bacillocin 602和bacillocin 1580）。乳酸菌和芽孢杆菌作为益生菌已在食品和饲料领域广泛应用，但其益生机制尚待进一步深入研究。今后工作重点为以下几个方面：（1）将细菌素作为此类益生菌遗传改良的重要筛选指标，定向突变和筛选高产细菌素菌株；（2）利用分子手段改良优化细菌素序列与结构，构建高产重组菌株；（3）提高目标益生成分的抗菌活性和结构稳定性；（4）注意突破细菌素对蛋白酶敏感、口服受限的瓶颈，探索有效运载和包被技术；（5）应用细菌素部分替代常规饲料抗生素的配套技术，为饲料抗生素减量使用做好铺垫。相信随着相关研究不断深入，细菌素在饲料安全、健康养殖方面将发挥重要的技术支持作用。

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