Hsp72对类风湿关节炎滑膜细胞IL-6、IL-8表达及NF-κ B活化的影响*

罗心静,莫选荣,周玲玲

(台州学院医学院生理学教研室,浙江 台州 318000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以累及周围关节为主要表现的系统性炎症性自身免疫病。其病理特征表现为关节滑膜炎症及骨质破坏。RA滑膜组织中的滑膜成纤维样细胞及其分泌的炎症因子IL-6和IL-8在RA滑膜炎症及骨质破坏中起到重要作用[1]。热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)72是细胞内含量最丰富的热休克蛋白,其基本功能起到“分子伴侣”作用。有证据表明,Hsp72能释放到细胞外环境(如血浆、脑脊液)中,可能参与对机体免疫功能的调节[2]。近年来研究发现在类风湿关节炎患者的关节液中存在高水平的Hsp72[3],但对其在关节滑膜炎症中的作用尚不清楚。本研究采用重组的Hsp72处理滑膜成纤维样细胞,观察Hsp72对IL-6、IL-8表达及NF-κ B信号通路活化的影响,以探讨Hsp72在RA关节滑膜炎症中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Hsp72重组蛋白(加拿大Stressgen公司;IL-6、IL-8 ELISA试剂盒(RD公司),TNF-α(美国R&D公司),PCNA小鼠单克隆抗体(美国BD Biosciences公司),GAPDH小鼠单克隆抗体、NF-κ B p65兔多克隆抗体、Iκ Bα兔多克隆抗体(美国 Santa Cruz公司),Hoechst 33258(美国Sigma公司),PVDF膜(美国Millipore公司),FITC标记的羊抗兔IgG(美国Sigma公司),DAB显色试剂盒(中国博士德生物公司)。

1.2 滑膜细胞的分离和培养

将关节置换术中所取下的新鲜RA患者滑膜组织剪碎,1 mg/ml胶原酶消化2 h,0.2%胰蛋白酶消化30 min。离心收集细胞,加入含 15%FCS的DMEM培养基,在5%CO2,37℃的湿润条件下贴壁培养,当细胞生长至融合时,用0.25%胰蛋白酶消化并按1/3比例分瓶传代培养。本研究使用滑膜成纤维细胞是 4～8传代细胞。细胞纯度为 95%(CD3、CD11b 、CD14、Von willibr and factor阳性细胞比例均小于1%)。

1.3 实验分组及处理

将RA滑膜细胞随机分为4组,对照组:未做任何处理;TNF-α组:单独用 20 ng/ml TNF-α刺激;Hsp72 组:单独用 1 μ g/ml Hsp72 孵育;Hsp72+TNF-α组:1 μ g/ml Hsp72预先孵育1h后再加入20 ng/ml TNF-α共孵育。

1.4 细胞因子检测

收集相应处理后的滑膜细胞培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清中IL-6和IL-8的含量。具体操作按相应试剂盒说明书进行。

1.5 细胞处理和细胞核蛋白及胞浆组分的分离

收集相应处理后的滑膜细胞,预冷的PBS洗涤,1 000×g离心1 min,弃上清,沉淀加入400 μ l预冷的缓冲液A(10 mmol/L HEPES pH 7.9;10 mmol/L KCl;0.1 mmol/L EDTA;0.1 mmol/L;EGTA;1 mmol/L DTT;0.5 mmol/L PMSF)冰上静置15 min破坏细胞膜,加入25 μ l预冷的 10%NP-40 混匀,涡流振荡10 s,3 000×g离心5 min,上清即胞浆蛋白组分。沉淀继续加入50 μ l预冷的缓冲液B(20 mmol/L HEPES pH 7.9;0.4 mol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;1 mmol/L EGTA;1 mmol/L DTT;1 mmol/L PMSF)冰上静置15 min破坏核膜,4℃下12 000×g离心 10 min,上清即核蛋白组分。

1.6 Western blot分析

将上述收集的上清液用Bradford法测定总蛋白浓度。将 20～30 μ g蛋白与 6×SDS加样缓冲液(187.5 mmol/L Tris-HCl pH 6.8,6%SDS,30%甘油,150 mmol/L DTT,0.1%溴酚蓝)混合,100℃煮沸10 min。样品经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,电转移法转移到PVDF膜上。室温下封闭4 h后,加入相应一抗,4℃过夜。洗去一抗后,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗,反应 2 h。随后用DAB显色,光密度扫描定量分析。

1.7 细胞免疫荧光分析

将滑膜细胞接种于铺有盖玻片的六孔板(1.0×105cells/well)中,于37℃,5%CO2浓度的二氧化碳培养箱中培养,待细胞在玻片上长成单层时,取出玻片,PBS清洗,多聚甲醛固定,0.1%Triton X-100通透20 min,加入2%BSA封闭 30 min,加入一抗,4℃过夜,洗去一抗后,加 cy3标记的二抗,孵育45 min,加Hoechst33258孵育2min,双蒸水清洗5min,吸干,中性树胶封片,荧光显微镜分析。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 Hsp72对IL-6和IL-8表达的影响

ELISA结果显示,TNF-α刺激滑膜胞细24 h后,IL-6和IL-8分泌增多,单独的Hsp72处理24 h对IL-6和IL-8的分泌并无明显影响,但Hsp72预处理1 h能显著降低TNF-α所致滑膜成纤维细胞IL-6和IL-8的分泌(表1)。

Tab.1 Effects of Hsp72on the expression of IL-6 and IL-8 in RA synoviocytes induced by TNF-α(ng/ml, ±s,n=6)

Tab.1 Effects of Hsp72on the expression of IL-6 and IL-8 in RA synoviocytes induced by TNF-α(ng/ml, ±s,n=6)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs TNF-αgroup

Group IL-6 IL-8 Control 5.2±0.6 2.6±0.7 Hsp72 4.8±0.9 2.3±0.8 TNF-α 17.0±3.8* 6.5±1.5*Hsp72+TNF-α 5.5±1.3# 4.6±1.1#

2.2 Hsp72对NF-κ B(p65)表达的影响

Western blot结果显示,正常对照组中,p65-NF-κ B在滑膜细胞核中表达很少,而在胞浆中表达较多;TNF-α刺激 30 min后,p65-NF-κ B在细胞核中表达明显增多,而在胞浆中表达明显减少;而Hsp72预处理能明显使TNF-α诱导p65-NF-κ B在细胞核中表达减少,而在胞浆中表达增多(图1)。

Fig.1 Hsp72 inhibitsTNF-α-induced nuclear translocation of NF-κ B detected by Western blot

2.3 Hsp72对NF-κ B(P65)核移位的影响

免疫荧光细胞化学技术显示,正常状态下,NF-κ B(p65)位于滑膜细胞浆中,滑膜细胞受TNF-α刺激30 min后,NF-κ B(p65)入核明显增多;Hsp72预处理抑制了对TNF-α诱导的NF-κ B(p65)核移位(图2)。

Fig.2 Hsp72 inhibits TNF-α-induced nuclear translocation of NF-κ B detected by immunocytochemistry(Immunofluorescence staining×200)

2.4 Hsp72对 TNF-α诱导所致I κ Bα降解的影响

Western blot结果显示,TNF-α刺激20 min左右,滑膜细胞中Iκ B明显减少,而Hsp72预处理能显著抑制 TNF-α诱导 Iκ B 降解 ,使细胞中 Iκ B 增多(图3)。

Fig.3 Hsp72 inhibits TNF-α-induced degradation ofI κ Bα

3 讨论

RA的发病机制目前尚未完全阐明,但是滑膜细胞及其分泌的细胞因子在RA滑膜炎症及骨质破坏中起到重要作用。研究表明,滑膜细胞受到炎症因子(如TNF-α)刺激时能表达和分泌多种促炎细胞因子,其中 IL-6和IL-8在 RA关节病变中起重要作用[1]。IL-6不仅能促进T细胞和B细胞的增殖和活化,调节急性期反应蛋白的表达,并且能促进多种炎症介质的生成[4]。IL-8是一种重要的趋化细胞因子,它能够引起血浆中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的渗出,促使这些炎细胞向炎症部位募集,在RA滑膜炎症发生发展中起重要作用[5]。

Hsp72是细胞内重要的应激蛋白,参与新生蛋白折叠和转移,在细胞内源性保护中具有重要作用。近些年研究表明,当细胞遭受各种刺激时Hsp72能被表达到细胞膜上或被释放到细胞外液中[6]。目前认为,细胞外Hsp72可作为细胞受损的一种“危险信号”,调节机体的固有免疫或适应性免疫反应。大量实验发现,重组Hsp72能促进单核/巨噬细胞、树突状细胞(DC)、血管内皮细胞合成和释放促炎因子和趋化因子 ,如一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1、IL-6 等 ,发挥促炎功能[7]。但也有学者发现,重组Hsp72能诱导抗炎细胞因子 IL-10的生成,从而发挥抗炎效应[8]。最近有报道,与骨关节炎(OA)患者相比,RA患者关节液中Hsp72含量显著升高,提示细胞外Hsp72可能参与RA的关节炎症。但细胞外Hsp72在RA炎症中的作用目前尚不清楚。本研究发现,虽然Hsp72单独处理对RA滑膜细胞IL-6、IL-8分泌并无显著影响,但能明显抑制TNF-α诱导的IL-6、IL-8分泌。这些研究表明,细胞外Hsp72对RA可能具抗炎作用。

NF-κ B通路是调节炎症反应的一条重要信号转导通路。转录因子NF-κ B在转录水平参与许多炎症介质基因的表达调节,是引起感染性疾病和自身免疫性疾病发生发展的重要机制之一[9]。哺乳动物转录因子NF-κ B主要是p65和p50亚家族蛋白结合形成的异二聚体。当细胞未受刺激时,NF-κ B与其抑制蛋白I κ B结合,以无活性的复合物形式存在于细胞浆中。当细胞受到炎性刺激时,I κ B被激活,随后发生磷酸化而降解。NF-κ B游离出来后活性恢复,然后移位进入细胞核。在细胞核内,NF-κ B与相应的靶基因启动子区的κ B位点相结合促使炎症介质基因的表达。研究表明,与骨关节炎相比,NF-κ B在RA滑膜组织中表达明显升高,而且体外实验也发现滑膜细胞遭受炎症因子刺激时NF-κ B活性增强[10]。为了阐明Hsp72抑制TNF-α所致的滑膜成纤维细胞IL-6、IL-8生成的机制,本研究观察Hsp72对TNF-α诱导的NF-κ B通路活化的影响。本研究显示,Hsp72能够明显减少TNF-α诱导的I κ B降解,并且能抑制NF-κ B的核移位,表明Hsp72能抑制RA滑膜细胞NF-κ B信号通路的活化而抑制炎症因子的产生和分泌。

总之,Hsp72下调了RA滑膜细胞IL-6、IL-8的产生和分泌,以及抑制NF-κ B信号通路的活化,提示细胞外Hsp72对RA可能具有抗炎作用。

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