孕酮对缺氧缺血新生鼠脑皮质HIF-1α表达的影响*

白瑞樱,刘雪琴,王 湜卿,李东亮△

(1.新乡医学院生理学与神经生物学教研室,河南 新乡 453003;2.济源职业技术学院护理系,河南 济源 454650)

研究表明,孕酮(progesterone,PROG)不仅可以在神经系统中合成和分泌,而且能影响其结构和功能,被称为“神经活性甾体”。本实验室以往的工作[1]和Ishrat最新的数据[2]都表明,PROG在脑缺血损伤中有脑保护作用,然而PROG脑保护作用的分子机制和途径尚不十分明了。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作为缺氧调节的重要因子,介导机体对缺氧缺血产生的适应性反应,能减轻神经损伤[3]。本文以缺氧缺血新生大鼠为研究对象,研究PR OG预处理对脑内HIF-1α表达的影响,进一步探讨PROG神经保护作用的分子机制,试图为临床治疗缺氧缺血性脑病提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

PROG(sigma公司,批号0130),实验前溶于芝麻油配成0.5 mg/ml备用;Trizol(Invitroge公司);Taq酶(上海生物工程公司);HIF-1α多克隆抗体(博士德公司);通用型二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6001),DAB显色系统(北京中杉试剂公司)。

1.2 动物分组及给药方法

7日龄SD大鼠80只,雌雄不限,体重 11～16 g(新乡医学院实验动物中心提供)。随机分成4组(n=10):正常对照组,假手术组,缺氧缺血组和孕酮组。正常组不做任何处理,孕酮组动物于建立模型前30 min按8 mg/kg腹腔注射PROG液,其余各组注射等容积PROG溶剂芝麻油。

1.3 动物模型建立[4]

7日龄大鼠乙醚麻醉后,颈部正中切口,分离和结扎右颈总动脉后缝合切口。然后将动物置于37℃低氧箱内,以1.5 L/min的速度输入80ml/L氧气和920 ml/L氮气,持续2 h,制备缺氧缺血模型。假手术组在颈部作一切口,仅分离右颈总动脉,不结扎,亦不予缺氧。

1.4 RT-PCR检测大鼠皮质区 HIF-1α的 mRNA表达

假手术组、缺氧缺血组和孕酮组于术后24 h,正常组于相应时间点,断头取右脑皮质,用Trizol试剂提取总 RNA(测定A260/A280＞1.8),以Oligo为引物逆转录为cDNA,进行PCR扩增目的基因。所用引物根据GenBank上所查序列,通过Primer 5.0程序自行设计,引物序列为:HIF-1αF-Primer:5′

GGA AAG AAC AAA ACA CGC AG 3′,R-Primer:5′ TTC ACA CACACA ATG CACTG 3′;β-actinF-Primer:5′ ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG 3′,R-Primer:5′ TCG TCC CAG TTG GTG ACA ATG 3′,由上海生物工程公司合成。循环条件为95℃、5 min;94℃、30 s;60℃、50 s;72℃、30 s,共 30 个循环。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,以Bander leader 3.0凝胶图像处理软件进行灰度分析,以目的基因与β-actin的扩增产物条带灰度值之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。

1.5 免疫组织化学检测大鼠皮质区HIF-1α的蛋白表达

动物术后24 h,在乙醚麻醉下开胸,暴露心脏,右心耳开洞放血,同时经左心室插灌注针直升至主动脉,并滴注生理盐水冲洗。继之灌注4%多聚甲醛30 min,断头取脑,冠状切取视交叉后2～4mm脑组织,置于4%多聚甲醛中固定4 h,常规梯度乙醇脱水、透明、包埋,连续冠状切片(厚4～6 μ m)。3%H2O2室温孵育10 min,微波抗原修复10 min,室温冷却2 h,正常血清封闭30 min,分别滴加一抗(兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗体,1∶200),4℃过夜,加入通用型IgG抗体-HRP多聚体,37℃ 孵育30 min,DAB显色8 min,脱水、透明、封片。每只动物取两张脑组织切片,400倍光镜下随机选取两个视野,用HMIAS-2000进行图像分析,由计算机系统自动计算出平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠皮质区 HIF-1α的mRNA表达

电泳条带灰度扫描分析结果显示,正常组、假手术组和缺氧缺血组皮质HIF-1αmRNA的表达无显著性差异(P＞0.05),而HIF-1αmRNA表达在孕酮组最高,明显高于正常组、假手术组和缺氧缺血组(P＜0.01,表1,图1)。

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PROG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;##P＜0.01 vs sham-operated group;△△ P＜0.01 vs hypoxic-ischemic group

Group Ratio of gray scale Normal-control 0.52±0.05 Sham-operated 0.51±0.06 Hypoxic-ischemic 0.52±0.06 PROG 0.78±0.06**##△△

Fig.1 Expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex

2.2 各组大鼠皮质区 HIF-1α蛋白表达

HIF-1α阳性细胞分布在大脑皮质和海马,胞核和胞浆均有表达,主要在胞核。正常对照组皮质区可见极少量HIF-1α表达,假手术组MOD值和正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05);缺氧缺血组皮质区HIF-1α表达增加,MOD值明显大于正常对照组(P＜0.01);孕酮组MOD值不仅明显高于正常对照组(P＜0.01),亦高于缺氧缺血组(P＜0.05,表2,图2见彩图页Ⅴ)。

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PR OG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;#P＜0.05 vs hypoxicischemic group

Group MOD value Normal-control 0.21±0.03 Sham-operated 0.21±0.02 Hypoxic-ischemic 0.38±0.03**PROG 0.55±0.04**#

3 讨论

缺氧诱导因子-1(HIF-1)广泛参与哺乳动物细胞缺氧诱导产生的适应性反应,是机体细胞适应低氧的重要转录调节因子。HIF-1是由α和β两个亚单位组成的异二聚体,细胞内的氧水平能够调节HIF-1α亚单位的稳定性、定位和促进转录的功能,而β亚单位则在细胞核中持续表达,其活性不受氧的影响[3]。

本实验结果显示,正常对照组可见有HIF-1αmRNA的表达和极少量的HIF-1α蛋白的表达,与假手术组相比,无显著性差异(P＞0.05),因而可以排除单纯手术对实验结果的影响。缺氧缺血组HIF-1αmRNA的表达与正常对照组和假手术组相比均无显著性差异(P＞0.05),但缺氧缺血组HIF-1α蛋白表达却增加,明显高于正常对照组及假手术组(P＜0.01)。可见缺氧并未引起HIF-1αmRNA的明显上调,但却使HIF-1α蛋白表达明显增加,表明缺氧不是在基因水平,而是在蛋白水平影响HIF-1α的表达。Liu等[5]在培养的新生鼠皮质神经元观察到了缺氧损伤引起的结果,而我们在整体动物上加以验证,细胞水平和整体水平获得的结果相一致。为什么缺氧时HIF-1αmRNA无变化,而HIF-1α蛋白表达却明显增加呢?在氧浓度正常的情况下,HIF-1α亚单位泛素化并经泛素-蛋白酶小体途径降解。而缺氧时脯氨酸羟化酶丧失功能,使HIF-1α不能被降解,并在核内聚集,最后与HIF-1β结合,识别缺氧反应靶基因启动子上的缺氧反应元件(HREs),使其靶基因表达增强。也就是说HIF-1α蛋白遇氧分解;而缺氧缺血时HIF-1α蛋白降解受阻,从而致 HIF-1α蛋白增加,而 HIF-1α mR NA则并未改变。

被称为“神经活性甾体”的PR OG,代谢产物具有麻醉,抗惊厥,抗焦虑和保护神经细胞的作用。本实验室也已证实PROG可明显减少大鼠缺血侧脑组织纹状体的钙含量,减轻细胞“钙超载”,起到对神经细胞的保护作用。也观察到PROG可减轻新生鼠缺氧缺血性脑水肿[4]。且PROG可以通过上调葡萄糖转运体的表达使脑内葡萄糖的转运增加,以维持缺氧缺血脑组织的能量供给,从而发挥脑保护作用[1,5],而葡萄糖转运蛋白也是HIF-1的靶基因。目前有报道,HIF-1α至少能调节70多个靶基因的表达:促进糖酵解代谢基因表达;促进葡萄糖转运基因表达;影响内皮素-1等基因的表达。这些变化使细胞、组织发生适应性和保护性改变,以减轻缺氧缺血性损伤。我们的研究结果显示,孕酮组大脑皮质HIF-1α在蛋白和mRNA表达水平均明显高于缺氧缺血组,孕酮对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用可能是通过其上调HIF-1α的表达实现的。由此我们推测,HIF-1可能在PROG介导缺氧缺血的脑保护作用中处于重要地位。或许这正是孕酮临床防治缺氧缺血性脑病的价值所在。

[1]李东亮,赵红岗,王东霞,等.孕酮对脑缺血再灌注大鼠纹状体水,钠,钾及钙含量的影响[J].中国病理生理杂志,2001,17(10):1012-1015.

[2]Ishrat T,Sayeed I,Atif F,et al.Effects of progesterone administration on infarct volume and functional deficits following permanent focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2009,1257:94-101.

[3]Chandel N S,Budinger G R.The cellular basis for diverse responses to oxygen[J].Free Radic Biol Med,2007,42(2):165-174.

[4]李 爽,徐春阳,姜洪波,等.孕酮对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织超氧化物歧化酶和基质金属蛋白酶3表达的影响[J].实用儿科临床杂志,2010,25(14):1056-1057.

[5]Liu J,Narasimban P,Yu F,et al.Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves oxidative stress-mediated expression of hypoxia-inducible factor and erythropoietin[J].Stroke,2005,36(6):1264-1249.