粤北山区并殖吸虫流行分布现状初步研究＊

傅广华，邓文强，刘 巧，陆予云，李旭文，陈少华，李宏光，王 萌

2.广州医学院卫生职业技术学院，广州 510925；

3.从化市中医医院，广州 510925

并殖吸虫（Paragonimus）俗称肺吸虫。某些种类可感染人引起人肺吸虫病（paragonimiasis），对人体健康危害极大。肺吸虫病是我国重要的人兽共患食源性寄生虫病之一。在早期的并殖吸虫流行病学研究中发现，广东粤北山区存在并殖吸虫疫源地，并有卫氏并殖吸虫（Paragonimuswestermani，）、斯氏狸殖吸虫（Pagumogonimusskrjabini，）感染的病例报告［1－2］。近年来，傅广华等人在粤北山区进行了并殖吸虫疫源地调查，新发现报告卫氏并殖吸虫与三平正并殖吸虫（Euparagonimuscenocopiosus，）疫源地各1处［3－4］。为了全面了解粤北山区并殖吸虫流行分布现状，并殖吸虫及第一、二中间宿主的种类，做好应对可能由并殖吸虫引发的公共卫生安全事件，采用现埸流行病学调查与分子生物学技术DNA序列分析相结合进行物种鉴定方法，于2008年8月至2011年10月对粤北韶关市所辖的乐昌市、南雄市、始兴县、翁源县、乳源县、新丰县、仁化县及曲江区等地进行并殖吸虫自然疫源地分布，并殖吸虫种类及中间宿主种类分布状况调查，现将初步研究结果资料汇总报告。

1 材料与方法

1.1 第一、二中间宿主采集与检查 粤北地区每个县、市各选择3～5个调查点，山溪中捕捉螺蛳1 000～3 000只、溪蟹30只～100只，按常规法解剖螺蛳、溪蟹，分别检查并殖吸虫尾蚴、囊蚴，并作螺蛳、溪蟹物种鉴定［5］。

1.2 保虫宿主粪便收集与检查 收集调查地附近村庄村民家中饲养的猫、犬粪便若干份，或调查地附近野生动物山猫粪便若干份。采用沉淀集卵法，取沉渣检查并殖吸虫卵。

1.3 人工感染动物试验 选择购自并殖吸虫非流行区成年家猫、家犬若干只，实验前进行粪便查找并殖吸虫卵，结果阴性雄性猫、犬用作动物试验。每只家猫饲喂并殖吸虫囊蚴50个，每只家犬饲喂并殖吸虫囊蚴200个，饲养100 d后取粪便查找并殖吸虫卵，剖杀粪便检查并殖吸虫卵阳性猫、犬，肺脏内查找并殖吸虫成虫。

2 结 果

2.1 第一、二中间宿主检查结果 乳源县、新丰县、仁化县各调查点采集的螺蛳、溪蟹样本均未检出并殖吸虫短尾尾蚴及囊蚴。南雄市珠玑镇里东、叟里元、下洞河3个调查点溪蟹检出三平正并殖吸虫囊蚴及体外脱囊的后尾蚴，见图1、2。感染率分别为74.54﹪ （41/53）、68.91﹪ （32/47）、77.77﹪（24/32）。溪蟹经福建省疾病预防控制中心程由注主任鉴定为平和华溪蟹 （Sinopotamonpinheense，），见图3、4。翁源县新江镇太坪调查点溪蟹检出三平正并殖吸虫囊蚴，感染率为76.92﹪ （40/52）。溪蟹物种鉴定为平和华溪蟹。曲江区小坑调查点溪蟹也检出三平正并殖吸虫囊蚴，感染率为81.5% （22/27）。溪蟹物种鉴定为平和华溪蟹。乐昌市乐城镇大洞调查点螺蛳检出并殖吸虫短尾尾蚴，见图5。感染率为0.058%（1/1 700），螺蛳物种鉴定为放逸短沟蜷（Semisulcospiralibertine，）见图6。溪蟹检出卫氏并殖吸虫吸虫囊蚴及体外脱囊的后尾蚴，见图7、8。感染率为38.09﹪ （32/84）。感染度：9.16个囊蚴/只蟹，0.58个囊蚴/g蟹。溪蟹物种鉴定为平和华溪蟹，见图3、4。结果见表1。

2.2 保虫宿主检查结果 对粤北地区6个市、县调查点采集的多份猫、犬粪便，采用沉淀集卵法均未检出并殖吸虫卵。

2.3 人工感染动物试验检查结果 取每个调查点溪蟹解剖检获卫氏并殖吸虫囊蚴或三平正并殖吸虫囊蚴，各感染猫、犬1条，饲养100 d后分别剖杀查找成虫。感染卫氏并殖吸虫囊蚴猫肺脏有7个囊包，共检获13条成虫和大量虫卵，见图9。感染卫氏并殖吸虫囊蚴犬肺脏有18个囊包，共检获34条成虫和大量虫卵。5条感染不同地点三平正并殖吸虫囊蚴猫肺脏分别有1～2个囊包，共检获12条成虫和大量虫卵，见图10。5条感染三平正并殖吸虫囊蚴犬肺脏分别有8～12个囊包，共检获83条成虫和大量虫卵。每只人工感染动物粪便检获虫卵形态结构特征与肺部囊包内检获虫卵相同。检获成虫虫体染色后，制成玻片装大体标本，镜下观察形态特征分别符合卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫，见图11、12。

2.4COI、ITS2基因DNA检测结果

2.4.1 COI与ITS2基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 用检获粤北地区新发现5处三平正并殖吸虫、1处卫氏并殖吸虫疫源地囊蚴，人工感染动物实验所获成虫样品，进行COI与ITS2基因PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图13、14。

2.4.2 COI与ITS2基因DNA序列分析测序结果人工感染动物实验所获成虫样品COI与ITS2基因PCR扩增产物进序列测序，结果见图15－18（为节约篇幅，P.w与E.c各列1个COI、ITS2基因序列结果图）。将每个样本测得COI与ITS2基因DNA序列与GenBank（美国国家生物工程信息中心、国立医学图书馆、国立卫生院联合成立，www.mcbi.nih.gov）检索三平正并殖吸虫 COI基因（AF159594.1）、ITS2基因（AF159602.1），卫氏并殖 吸 虫 COI 基 因 （AY140694.1）、ITS2 基 因（AB354217.1）进行NCBI Blast序列比对，里东、叟里元、下洞河、大坪、小坑成虫样本COI基因序列与GenBank检索三平正并殖吸虫COI基因序列同源性分别为：99.5% （319/320个碱基）；100% （320/320个碱 基）；99.5% （329/330 个 碱 基）；99.5%（299/300个碱基）；100% （334/334个碱基），大洞成虫样本COI基因序列与GenBank检索卫氏并殖吸虫COI基因序列同源性100% （334/334个碱基）。里东、叟里元、下洞河、大坪、小坑成虫样本ITS2基因序列与GenBank检索三平正并殖吸虫ITS2基因序列同源性分别为：100%（349/340个碱基）；100% （360/360个碱基）；100%（360/360个碱基）；100%（360/360个碱基）；100% （360/360个碱基），大洞成虫样本ITS2基因序列与GenBank检索卫氏并殖吸虫ITS2基因序列同源性99.5%（415/420个碱基）。

表1 不同调查点样本检查结果Tab.1 Sample test in different survey sites

图13 COI基因PCR扩增电泳结果1：里东；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸虫；6：大洞卫氏并殖吸虫；M：PCR标志物Fig.13 PCR amplification results on electrophoresis of COL gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

图14 ITS2基因PCR扩增电泳结果1：里东；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸虫；6：大洞卫氏并殖吸虫；M：PCR标志物Fig.14 PCR amplification results on electrophoresis of ITS2 gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

图15 三平正并殖吸虫COI基因序列Fig.15 E.C COI gene sequences

图16 三平正并殖吸虫ITS2基因序列Fig.16 E.C ITS2 gene sequences

图17 卫氏并殖吸虫COI基因序列Fig.17 P.w COI gene sequences

图18 卫氏并殖吸虫ITS2基因序列Fig.18 P.w ITS2 gene sequences

3 讨 论

粤北地区地处南岭山脉之南，珠江水系的北江上游。地理位置介于东经112°50′～114°45′，北纬23°53′～25°31′。属南亚热带和北亚热带过渡带并以中亚热带气候为主的湿润性季风型气候，年平均气温18～21℃，植物种类繁多，森林覆盖率高达76.6%。多数山溪水流终年不枯。良好的自然生态环境，适合于并殖吸虫第一中间宿主淡水螺类，第二中间宿主溪蟹类，终宿主猫科类动物如果子狸、野猫等繁衍生息。为并殖吸虫的生活史环节提供了天然适宜的地理环境条件。根据目前已获得研究结果显示，粤北部分山区乃存在并殖吸虫自然疫源地。结果1中南雄、翁源和曲江三个市、县5个调查点溪蟹体内检获三平正并殖吸虫囊蚴，乐昌市1调查点螺蛳体内检获并殖吸虫短尾尾蚴，溪蟹体内检获卫氏并殖吸虫囊蚴。依据幼虫尾蚴、囊蚴，人工动物感染实验检获成虫及虫卵的形态结构特征鉴定，成虫样本的DNA测序结果比对分析联合鉴定，本项研究在粤北四市、县山区新发现三平正并殖吸虫自然疫源地5处，卫氏并殖吸虫自然疫源地1处。从5处三平正并殖吸虫疫源地采集的放逸短沟蜷中均未检出短尾尾蚴。自1962年陈心陶首次发现三平正并殖吸虫至今已40余年，众多的研究者为揭开三平正并殖吸虫第一中间宿主之迷进行了大量的研究工作，至今未果［3］。本项研究中5处新发现三平正并殖吸虫第一中间宿主暂时也是一个未知之迷。而新发现卫氏并殖吸虫疫源地的第一中间宿则为放逸短沟蜷。值得注意的是，本项研究新发现的所有三平正并殖虫与卫氏并殖吸虫疫源地第二中间宿主淡水蟹种，均为平和华溪蟹。与陆予云等近年在广东省新发现多处卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫疫源地第二中间宿主相同，提示在粤北乃至广东省平和华溪蟹是一个淡水蟹优势种，也是广东省并殖吸虫的主要第二中间宿主。根据樊培方（1980）提出：以第二中间宿主囊蚴感染率及感染程度计算感染指数来划分疫区等级［10］，南雄市里东、叟里元、下洞河3个调查点溪蟹三平正并殖吸虫囊蚴感染指数分别为1.70、1.67、1.83，翁源县大坪调查点为1.84，曲江县小坑调查点为1.92。乐昌市大洞调查点溪蟹卫氏并殖吸虫囊蚴感染指数为1.92。各调查点囊蚴感染指数均在1～99之间。因此，本项研究至今在粤北四市、县山区新发现三平正并殖吸虫与卫氏并殖吸虫自然疫源地均为高度疫源地（II级）。鉴于卫氏并殖吸虫是我国主要致病肺吸虫虫种，应做好疫源地人群中可能发生的并殖吸虫感染防制措施，防止可能由此引发的公共卫生安全问题，保障疫源地人群身体健康。DNA测序研究结果显示：5处三平正并殖吸虫样本COI基因序列与GenBank检索基因（AF159594.1）同源性分别为99.5%～100%之间。ITS2基因序列与检索基因（AF159602.1）同源性均为100%。卫氏并殖吸虫样本COI基因序列与GenBank检索基因（AY140694.1）同源性为100% 。ITS2基因序列与检索基因（AB354217.1）同源性均为99.5% 。迄今为止，检测生物种DNA序列在亲缘关系及物种分类鉴定上均具有重要价值。目前公认，并殖吸虫COI基因适用于种遗传差异的研究，ITS2基因适用于并殖吸虫种间差异的研究［11］。结合本项研究中上述各样本DNA测序比对结果分析，粤北四市、县山区新发现5处三平正并殖吸虫自然疫源地虫种之间亲缘性无差异性，并且与GenBank检索基因也无明显差异性。卫氏并殖吸虫自然疫源地虫种与GenBank检索基因亲缘性无明显差异性。

本项研究中溪蟹物种鉴定得到福建省疾病预防控制中心程由注主任帮助，在此表示感谢！

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