并殖吸虫实验室检测方法研究进展

杨荣笙，汪天平

安徽省寄生虫病防治研究所，安徽 合肥 230601

并殖吸虫病（paragonimiasis）是因食入并殖吸虫感染期囊蚴而引起的急、慢性寄生虫病，成虫主要寄生于人或哺乳动物的肺内，俗称肺吸虫病（lung fluke disease），它是一种重要的自然疫源性人兽共患病。目前，已报道的并殖吸虫有50多种[1]，其中，广泛分布于亚洲且具有致病性的虫种主要有卫氏并殖吸虫（P. westermani）、斯氏并殖吸虫（P.skrjabini）、异盘并殖吸虫（P.heterotremus）和宫崎并殖吸虫（P.miyazakii）。并殖吸虫病呈世界性流行，全球约有2 300 万并殖吸虫感染者[2]。我国是并殖吸虫病重度流行区，27 个省份均有过病例报道[1]。并殖吸虫病临床症状往往缺乏特异性，极易误诊与漏诊[3]，因此准确、及时地检测并殖吸虫尤为重要。目前，常用的并殖吸虫实验室检测主要有病原学、免疫学以及分子生物学方法，本文就并殖吸虫的实验室检测方法研究进展综述如下。

1 病原学方法

在感染者粪便或痰液中查出并殖吸虫虫卵即可确诊并殖吸虫病[1,4]。并殖吸虫寄生在宿主的肺部，可因病变破损经咳嗽随痰液带出虫卵，或因吞咽痰液随粪便排出虫卵。痰检虫卵多采用NaOH消化离心沉淀法，粪检虫卵常用生理盐水直接涂片法、自然沉淀法和Kato-Katz 法，但对感染度较低或异位寄生的患者，上述方法敏感度较低[5-7]，对虫卵的主观判断也要求实验人员具有一定的专业知识及经验。Slesak 等[8]采用Ziehl-Neelsen 染色法检测慢性咳嗽患者痰液中并殖吸虫虫卵，敏感性为76.9%。Ziehl-Neelsen 染色法可使并殖吸虫虫卵在蓝色背景下呈黄色至棕色，便于鉴定，经济安全[9]，是较为理想的诊断方法。

2 免疫学方法

免疫应答是机体维持内环境稳定的重要手段。感染并殖吸虫后宿主体内可检测到特异性抗原或抗体[10]，无论是虫体产生的抗原或是机体免疫应答产生的抗体均有很大的诊断价值。随着免疫学技术的不断进步，并殖吸虫免疫学诊断或检测的效率也在不断提高，在临床与科研工作中被广泛应用。

2.1 皮内试验 皮内试验（intradermal test,IDT）是用特异性抗原进行皮内注射，根据皮肤反应判断人体内有无相应抗体。Song 等[11]采用IDT 法检测并殖吸虫抗体，测得阳性率为26.35%（248/941），再对其中128 名IDT 阳性者的痰液进行并殖吸虫虫卵检测，仅 4 例发现虫卵。Zhang 等[12]对三峡库区 724 名受试者进行并殖吸虫IDT 和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），阳性率分别为14.36%和7.46%，ELISA 检测阳性者IDT检测均为阳性。IDT法操作简便快速，灵敏度高，无需特殊仪器，常用于并殖吸虫病早期筛查。但该检测方法假阳性率较高，不适于疗效评估，且会对受试者皮肤造成一定损害[13-15]。IDT 检测结果需结合其他方法综合判定。

2.2 酶联免疫吸附试验 ELISA 是将特异性抗原包被于固相载体，与待测抗体及酶标抗抗体反应，显色后可测得感染者体内相应抗体含量。目前，已利用并殖吸虫的成虫抗原和排泄分泌抗原建立相应的ELISA 检测方法，特异性与灵敏度较高，但仍存在一定的交叉反应[16-17]。在ELISA 基础上建立的Dot-ELISA（Dot-enzyme-linked immunosorbent assay）检测技术操作更为简便快速、抗原用量更少。用并殖吸虫幼虫排泄分泌（excretory-secretory，ES）抗原作为诊断抗原的Dot-ELISA敏感性可达100%，且与其他寄生虫无交叉反应[18]。随着基因重组技术的逐步发展，并殖吸虫重组主要虫卵抗原[19]、斯氏并殖吸虫重组半胱氨酸蛋白酶（paragonimus skrjabinicysteine protease，PsCP）[20]建立的ELISA检测技术也取得了较好效果。ELISA 法操作较为简单，敏感性与特异性较高，常用于临床检验，但IgG水平检测结果无法区分近期和既往感染情况。

2.3 蛋白质免疫印迹法（western blot, WB） WB的基本原理为将经过PAGE分离的并殖吸虫蛋白质组分转移到固相载体上，与相应抗体及抗抗体特异性结合，阳性反应可出现肉眼可见的条带，从而检测出目的蛋白。Ahn 等[21]用免疫印迹法分别检测卫氏并殖吸虫11 种不同半胱氨酸蛋白酶（paragonimus westermanicysteine proteases，PwCPs），敏感性为38.4%～84.5%，特异性为87.2%～100.0%。同样有实验表明，肌红蛋白在免疫印迹法检测并殖吸虫中也表现出了极高的诊断价值[22]。Fischer等[23]建立了可识别出分子量为34 kDa 和21/23 kDa 诊断蛋白的并殖吸虫抗原IgG蛋白印迹法，灵敏度高，并可动态监测到经吡喹酮治疗成功的患者血清抗体减弱的趋势。WB 法广泛应用于蛋白水平表达的检测，常应用于科研试验中，操作较为耗时，对技术人员与实验室要求较高。

2.4 免疫层析试验（immunochromatographic test,ICT） ICT的基本原理为待测抗原或抗体通过与层析材料中的反应试剂特异性结合，阳性反应可在层析条上的特定区域出现肉眼可见的检出线。Wang等[24]采用纯化的兔抗人IgG 与胶体金偶联，检测并殖吸虫感染者血清抗体，以并殖吸虫ES抗原包被硝基纤维素膜作为捕获线，重组葡萄球菌蛋白A 制备控制线，试验敏感性和特异性可达94.4%和94.1%。Sadaow 等[25]利用并殖吸虫ES 抗原开发的快速检测并殖吸虫免疫层析试剂盒，敏感性和特异性达97.9%和87.6%。ICT 法操作简单、快速，不需要特殊设备或训练有素的操作人员，结果读取简单，适用于基层筛查与临床的“床边检验”，但该法仍存在一定的交叉反应[25]。

2.5 斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay, DIGFA） DIGFA 是将并殖吸虫特异性抗原呈点状加在固相载体上，与待测抗体及金标抗抗体特异性结合后，阳性反应可呈红色斑点状。马安等[26]利用并殖吸虫成虫粗提液抗原建立检测并殖吸虫特异性IgG4 方法，敏感性为100.0%，特异性为95.2%，交叉反应低，对患者的疗效评估有诊断价值。DIGFA 法在并殖吸虫流行区的现场应用上，特异性和敏感性较高，与常规ELISA 平行对照检测结果具有较好的一致性[27-28]。DIGFA 法无需实验仪器，操作非常简单，肉眼可判断结果，适合现场应用。但该法易产生假阳性结果，临床应用较少[29]。

2.6 免疫组化技术（immunohistochemistry techniqu,IHC） 免疫组化技术的基本原理为利用抗原抗体反应与组织化学的呈色反应相结合，在组织细胞原位标记特异性抗体，对相应抗原进行定位、定性和定量检测。Curtis 等[22]利用免疫组织学定位技术鉴别出可能寄生于人体的并殖吸虫分泌或定位于寄生虫-宿主界面的蛋白质，如重组半胱氨酸蛋白酶和肌红蛋白。实验显示并殖吸虫病患者对重组并殖吸虫副肌球蛋白有抗体反应[30]。免疫组化技术特异性强、敏感性高，从细胞水平检测并殖吸虫抗原。但非特异性染色问题需要注意，结果判定的主观性较强，技术程序较为复杂。

3 分子生物学方法

20世纪70年代以来，分子生物学检测技术在并殖吸虫感染的诊断中发挥了巨大的作用，标本虫期以及保存方法的不同均不会影响分子遗传的研究结果[31-33]。

3.1 DNA 序列分析 DNA 序列分析是根据识别基因碱基序列鉴定所测物种。并殖吸虫的核基因ITS2（ribosomal second internal transcribed spacer）、线粒体基因CO1（partial mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1）、NADH 脱氢酶亚基ND1（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 1）和逆转录子Rn1（retrotransposon 1）等基因序列均被证实可有效应用于并殖吸虫检测[34-38]，CO1 比ITS2更适合于区分亚种关系[39]。Rosa等[40]对不同并殖吸虫的基因组进行了测序、组装、注释和比较，为并殖吸虫的研究提供了宝贵资源。传统的DNA 序列分析需基于PCR 检测技术，对扩增产物凝胶电泳后进行测序。新型的由4 种酶催化的DNA 焦磷酸测序技术则无需电泳，操作更为简便快速。Tantrawatpan等[41]利用DNA 焦磷酸测序技术成功测定并殖吸虫ITS2基因序列。

3.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） 并殖吸虫ITS2和CO1序列常被用作PCR 扩增引物设计的靶基因。Chang 等[42]对1 例并殖吸虫病患者痰中的虫卵进行PCR 扩增测序，得到并殖吸虫完整核糖体DNAITS2 基因序列从而确诊。赵昕等[43]根据卫氏并殖吸虫ITS2 序列设计的PCR 引物特异性强，灵敏度达100 pg/μL。PCR 法操作简便，商品化试剂盒较多，在实验室与临床应用广泛[44-46]，但本法需要特定的仪器设备，反应过程中需注意非特异性扩增。

3.3 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR） RT-qPCR在PCR的基础上利用检测荧光信号在反应体系中的变化达到实时监测整个反应过程的目的，检测结果以标准曲线图呈现。赵昕等[43]用一套针对卫氏并殖吸虫ITS2 序列的引物成功在不同并殖吸虫中鉴别出卫氏并殖吸虫，灵敏度可达0.1 pg/μL，高于PCR 法三个数量级。Tantrawatpan 等[47]将实时荧光共振能量转移PCR 和熔化曲线分析相结合，用一套引物和针对28SrDNA区域的荧光标记杂交探针建立了异盘并殖吸虫特异性检测新方法，灵敏度为每100 mg 粪便中检出1个并殖吸虫虫卵。RT-qPCR 法使分子生物学检测技术迈入了反应过程可视化阶段，给定量研究带来了极大便利，但此法成本较高，标准曲线的绘制较为重要。

3.4 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP） LAMP 法 是 21 世纪 初发明的一种仅用水浴锅即可现场快速扩增核酸的高通量检测方法。Chen 等[48]建立了针对ITS2 基因的LAMP 技术，可有效检测不同样本中的卫氏并殖吸虫，灵敏度为1×10-8ng/μL，比常规PCR法敏感100倍。Zhuo 等[49]利用卫氏并殖吸虫Rn1 序列设计引物，在LAMP 的基础上建立了并殖吸虫LAMP-LFD（横向流动探针）快速检测方法，灵敏度为2.7 fg/L，同比PCR 法灵敏度为27 fg/L。LAMP 法高效快速，操作较为简单，较其他分子学诊断技术相比，不需要特殊仪器，适合现场应用，但不适于长链DNA 的扩增。

4 结 语

并殖吸虫实验室检测方法的研究与建立一直在不断发展和进步。病原学检查虽然费时费力、检出率不高，但在现场应用中仍不可或缺；免疫学检查IgG抗体虽无法评判疗效，但抗原、抗体的正确选择仍可给感染早期、轻度、寄生部位隐蔽的并殖吸虫患者提供检测参考；分子生物学检查虽对实验环境和人员要求较高，但其精准的检测能力从基因层面上呈现了并殖吸虫的生物多态性，为其确诊提供了依据，是未来诊断发展的方向。总体来看，开发先进的、标准化的以及敏感性高、特异性强的实验室检测方法，是今后的研究方向[50]。目前，需要因时因地制宜，综合选择不同的并殖吸虫实验室检测方法，以提高检测能力[51]。