并殖吸虫的分类和遗传多样性研究概述

顾梦杰，李友松，董惠芬，赵琴平

并殖吸虫(Paragonimus)隶属扁形动物门、吸虫纲、复殖目、并殖科、并殖亚科，大多寄生于兽类，其幼虫在宿主体内四处游走窜扰，成虫在终宿主的肺部定居而引起肺吸虫病(Paragonimiasis)。迄今为止，已报道并殖吸虫属的典型种有：卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、大平并殖吸虫和异盘并殖吸虫等30多种。能引起典型的人体肺吸虫病的主要有8种，包括：卫氏并殖吸虫、宫崎并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、异盘并殖吸虫、双侧宫并殖吸虫、非洲并殖吸虫、克氏并殖吸虫和墨西哥并殖吸虫[1]。其中，卫氏并殖吸虫分布最为广泛，是导致人体肺吸虫病的重要病原体。随着世界范围内不同虫种的陆续报道，有必要对其进行科学统一的鉴定和分类。系统形态学分类明确了许多虫种间的表观差异，近年的分子生物学研究揭示了并殖吸虫的遗传变异具有多态性。本文主要对并殖吸虫的分类和遗传多样性的相关研究作一综述。

1 分类学研究

1.1形态学 最早发现的并殖吸虫是在南美巴西水獭体内，当时将其命名为粗壮双口吸虫(DistomarudeDiesing, 1850)[2]，但因对其形态学描述简单，且再未检获该样本，所以对其身份仍存疑。后在印度獴(Mongoose)的肺部发现了一种坚实双口吸虫(D.compactumCobbold, 1859)[3]，这是最早确定为并殖吸虫的虫种。1877年，Westerman在对一只孟加拉虎进行尸检时，在其肺部发现寄生虫，荷兰动物学家Kerbert通过形态学，对该虫体和与其它吸虫对比后，鉴定其为新种，并定名为：卫氏双口吸虫(D.westermaniKerbert, 1878)[4]。次年，发现该类吸虫能引起人类疾病，第一例人体感染的病例报告发生在尚为葡属殖民地的中国台湾，英国医生Ringer在对病人尸检时发现虫体，经英国学者Cobbold确认，将这种在人体内获得的吸虫命名为林氏双口吸虫(D.ringeriCobbold, 1880)[5]。两月后，Baelz在日本也发现在人体中寄生的肺吸虫，将其命名为肺生双口吸虫(D.pulmonalisBaelz, 1880)[6]。随后，有学者认为寄生在虎肺内的卫氏双口吸虫与寄生在人肺内的肺生双口吸虫在形态学特征上表现一致，遂统称为卫氏双口吸虫[7]。Braun于1899年将双口吸虫属(GenusDistoma)改为并殖吸虫属(GenusParagonimus)，并将卫氏并殖吸虫作为并殖属的模式种，以观察成虫形态差异，作为区分并殖吸虫和其他种类吸虫的主要手段[6]。

1.1.1成虫 1915年Ward 和Hirsch[8]比较了林氏(ParagonimusringeriCobbold, 1880)、卫氏(P.westermaniKerbert, 1878)和首次在北美发现的克氏(P.kellicottiWard, 1908)三类并殖吸虫的成虫形态，发现：林氏的体棘为浓密凿状丛生型，卫氏的体棘为稀疏细针状单生型，而克氏则为浓密凿状单生型。因此，认为成虫体棘的形态和排列特征可作为划分并殖吸虫属下各种(当时仅报告有5种)的分类依据。Vevers[9]于1923年重新观察了上述3种并殖吸虫和坚实并殖吸虫(P.compactusCobblold, 1859)的形态，肯定了成虫体棘在区分并殖属各成员中的分类学意义。Ameel[10]在研究克氏并殖吸虫生活史时，发现克氏并殖吸虫的体棘大小、形状和分布情况在虫体的不同部位或不同个体间存在较大的变异，且随着虫龄的增长，体棘会由细针状变粗，针尖变钝，呈凿状。因此，认为体棘特征不宜作为并殖吸虫的分类依据。我国学者在对四川肺吸虫(P.szechuanensicChung & T’sao, 1962)(现证明是斯氏并殖吸虫(P.skrjabiniChen, 1959)的同物异名)生活史的研究中亦发现，成虫体棘的形状和排布存在过渡型[11]。

1974年Miyasaki[12]报道了卵巢的形状和睾丸的大小在并殖吸虫不同种间的差异，例如卫氏并殖吸虫卵巢为6页扇状叶片，墨西哥并殖吸虫(P.mexicanusMiyazaki&Ishii, 1968)则为纤细的分支；巨睾并殖吸虫(P.macrorchisChen, 1962)的睾丸巨大，而哈氏并殖吸虫(P.harinasutaiMiyazaki&Vajrasthira, 1968)和亚马逊并殖吸虫(P.amazonicusMiyazaki, Grados&Uyema, 1973)的睾丸则较小，认为生殖器官的形态学差异可用于并殖吸虫种间的鉴别。

此外，成虫的长宽比和吸盘相对位置在虫种间亦有区别。卫氏并殖吸虫、大平并殖吸虫(P.ohiraiMiyazaki, 1939)和异盘并殖吸虫(P.heterotremusChen&Hsia, 1964)等成虫的虫体宽长比通常在1∶2以下，腹吸盘位于体中线处，而斯氏并殖吸虫的成虫宽长比则达1∶2.4以上，腹吸盘偏移到体前侧1/3处[13-17]。

1.1.2囊蚴 不同虫种间囊蚴的变异特征最多。囊蚴的大小和形状、囊壁的有无和厚薄、吸器的相对直径、排泄囊的位置、口咽针的有无和长度、彩色颗粒的有无[18]、焰细胞的数量、体棘和吸器周围的乳突(Papillae)排列等，均在种间有不同程度的差异。丰宫并殖吸虫(P.proliferusHsia&Chen, 1964)的囊蚴直径可达0.75 mm以上，常呈椭圆形，大平并殖吸虫的囊蚴直径仅约0.25 mm。卫氏和斯氏等大多数并殖吸虫具有2层囊壁，怡乐村并殖(P.iloktsuenensisChen, 1940)(大平并殖吸虫的同物异名)和卡里并殖吸虫(P.caliensisLittle, 1968)则仅有1层囊壁，极少数种类例如墨西哥并殖吸虫则没有囊壁，不过亦有人认为可能是由于囊壁太薄而在取样时丢失[7]。陈心陶曾根据焰细胞数量将并殖科分为并殖属和狸殖属，因为大多数并殖属吸虫的焰细胞数目为60个，而斯氏并殖、丰宫并殖和曼谷并殖吸虫的焰细胞数则为72个[19]，但因该分类依据单一，并未得到国际学界的广泛认可。

种内的囊蚴也存在一定程度的特征变异。在电镜下观察同种大平并殖吸虫的囊蚴，其内囊壁在个体间或有或无[20]。曾经认为宫崎并殖吸虫的囊蚴大于卫氏并殖吸虫的囊蚴，但随后发现不同地区的卫氏并殖吸虫囊蚴大小相差很大，最小的与大平并殖吸虫囊蚴大小近似(直径约250μm)，最大的可超过丰宫并殖吸虫囊蚴(直径约750μm)。

1.1.3虫卵 不同种的虫卵亦存在大小、形状和卵壳特征的差异。卫氏并殖吸虫的二倍体虫卵明显小于三倍体虫卵，且最宽处接近虫卵横中线，而三倍体虫卵的最宽处则接近卵盖[21]。多数并殖吸虫卵壳光滑，如克氏并殖吸虫和大平并殖吸虫，也有部分虫种的卵壳呈凹凸状或乳头状突起，如卫氏并殖吸虫和墨西哥并殖吸虫[22]。

随着越来越多的新种被报道，一贯沿用的形态学上的分类依据逐渐受到挑战；特别在进行大样本量的观察时，发现其并不适用于种内变异度高的虫种。某些新性状的出现可能仅由偶然因素导致，比如：卫氏并殖吸虫的囊蚴在形成过程中，由于寄生部位压力不均，发育为扁形，而得名为扁囊并殖吸虫[23]；将泡囊并殖吸虫的囊蚴置于生理盐水中，排泄囊可由宽变细，经生活史循环试验和DNA检测，确认为斯氏并殖吸虫的畸形囊蚴[24]。

迄今，尚无一种特异性的形态学特征可作为并殖吸虫种间的分类依据，虫种的鉴别一般需根据囊蚴、成虫和虫卵等的形态综合判断。我国已有学者总结以往经验，以成虫或囊蚴的形态特点为基本依据，建立了中国的并殖吸虫分种检索表[25]，为我国并殖吸虫的调查研究和分类识别提供了参考资料。

1.2分子分类 随着测序技术的发展，基因序列标记的运用使得研究物种间的系统进化关系成为可能。根据核基因序列可以判断个体的杂合或纯合情况，由碱基序列的同源性程度能够量化群体间的亲缘关系；根据线粒体基因组序列，可以推知家系起源。得益于此，在对并殖吸虫种系关系的探索中，分子证据极大地丰富了我们对并殖属吸虫大家族的认识。

1.2.1核基因标记 内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)位于染色体上rRNA的大小亚基之间，包括ITS1和ITS2，因其具有拷贝多、易扩增、种间变异度高等特点，常被用于系统发育研究。Herwerden[26]研究发现，卫氏并殖吸虫的ITS1重复区在个体内具有1～3个重复单元组成的串联变体，而大平并殖吸虫仅有唯一的一种串联单元。此外，卫氏并殖吸虫等位基因间的协同进化速率较慢，提示其染色体联会时交叉频率F.X.(The frequency of chiasma formation)可能低于大平并殖吸虫。在对ITS1的3′端的后重复区的分析中发现，卫氏并殖吸虫的个体间变异程度远大于大平并殖吸虫，其种群拥有更多的遗传多样性。ITS2则更为保守[27]，中国的斯氏并殖吸虫与日本的宫崎并殖吸虫的ITS2序列完全相同；中国台湾、日本、菲律宾和马来西亚等地卫氏并殖吸虫样本的ITS2序列仅有数个碱基的差异；此外，并殖吸虫属种间碱基置换率亦低于10%[28]。因此，ITS2可作为分析并殖吸虫属种间关系的良好标记，但无法用于种内遗传结构的研究。

Jarilla[29]在对吸虫和软体动物激酶的进化关系研究中发现，卫氏并殖吸虫的脒基牛磺酸激酶(Taurocyamine kinase, TK)基因是一个双域编码序列，由软体动物的精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)基因进化而来。脒基牛磺酸激酶参与牛磺酸和亚牛磺酸代谢，催化磷酸基团在ATP和脒基牛磺酸之间的可逆转移。Saijuntha等[30]以TK基因1号域第2内含子(The second intron of domain 1 of the taurocyamine kinase gene, TKD1int2)序列作为分子标记，对卫氏、大平、怡乐村和宫崎并殖吸虫进行遗传变异分析，结果显示：大平并殖吸虫TKD1int2序列有11处位点变异，怡乐村并殖吸虫则无变异；宫崎并殖吸虫有4个位点存在变异；卫氏并殖吸虫则多达108个变异位点；聚类分析不能区分大平并殖吸虫和怡乐村并殖吸虫。该研究再次证实了卫氏并殖吸虫在种内呈高度变异，较其他虫种种群遗传多样性更高，同时提示了大平并殖吸虫和怡乐村并殖吸虫可能为同一虫种，与ITS2和CO1的检测结果相符[31]，但是两虫种间的变异度不同，亦提示两者间可能存在分化。

1.2.2线粒体基因标记 细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase, COX)是有氧代谢的关键酶，作用于线粒体氧化磷酸化反应的最后阶段，参与电子链传递。细胞色素c氧化酶亚基I(CO1)是细胞色素c氧化酶的主要亚基。CO1序列在并殖吸虫种内具有更多的变异位点，能够为卫氏并殖吸虫的种内遗传结构研究提供更丰富的信息，可区分ITS2不能区分的斯氏并殖吸虫和宫崎并殖吸虫(P.miyazakiiKamo et al., 1961)，但由于并殖吸虫属CO1序列碱基置换数已近饱和，在计算差异较大的两类并殖吸虫的遗传距离时，常会低估两者的分化程度[28]。因此，将CO1与ITS2两种标记一起使用，更有利于虫种鉴别和发育关系分析。2007年Doanh等在越南北部检获一种大型囊蚴，与巨睾并殖吸虫和丰宫并殖吸虫等的囊蚴形态有部分相似，但对其CO1和ITS2序列的聚类分析显示，该种独立成一支，与其他已知种隔离，故认为其为新种，命名为越南并殖吸虫(P.vietnamensis)[32]。此外，作者对另一种形似丰宫并殖吸虫的大囊蚴，进行CO1和ITS2序列分析，鉴定其为河口并殖吸虫，此为首次报道越南境内河口并殖吸虫的分布[33]。除CO1外，亦有学者尝试利用线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit 1, ND1)基因进行并殖吸虫的分类学研究[34]，但由于ND1在并殖吸虫个体内为多拷贝，使其无法广泛运用于系统发育分析[35]。

2 种群遗传多样性

2.1种内多样性 以模式种卫氏并殖吸虫为例，种内的成虫、虫卵和囊蚴大小存在较大差异。成虫体长5.1 mm～15 mm，宽3.7 mm～6.3 mm，宽长比1∶(1.3～2.3)；虫卵大小也随宿主、地区和虫龄不同存在差异，长宽范围为(51～102)μm×(38～72)μm[7]。东亚地区的卫氏并殖吸虫囊蚴呈圆形，内囊壁较厚，三倍体囊蚴长宽范围为(348～412)μm×(328～396)μm，大于二倍体的(276～368)μm×(272～360)μm[21, 36]。而印度东北地区和斯里兰卡的囊蚴则含卵形，内囊壁较薄，大小分别约为656 μm×465 μm和709 μm×492 μm[37-38]，经成虫的形态学和分子鉴定均为卫氏并殖吸虫，作者推测这种形状变化可能与囊蚴在中间宿主体内的寄生位置有关。此外，在分子水平上，Blair[28]使用ITS2与CO1序列，对中国(福建省和台湾省)、日本、韩国、菲律宾、马来西亚和泰国等地的卫氏并殖成虫构建系统发育树，按遗传距离的远近将其分为两个地域组群，中国、日本和韩国等地株系为东北组群，菲律宾、马来西亚和泰国等地理株为南部组群。两群间遗传差异较大，对中间宿主螺的种属选择上也有差异。并且不同地理株间CO1基因变异度很高，东北组群和南部组群地理株之间的CO1基因遗传距离甚至与不同种的斯氏并殖吸虫和宫崎并殖吸虫的种间遗传距离相似。Iwagami[39]同样使用ITS2和CO1基因对亚洲卫氏并殖吸虫进行了发育关系研究，结果与Blair相似，中国(吉林省、辽宁省、湖北省、浙江省、福建省和台湾省)、日本和韩国，除中国台湾省有一处位点变异外，其他样本的ITS2序列完全一致，与菲律宾、马来西亚和泰国样本差异明显。根据CO1基因的聚类结果，中、日、韩的所有样本之间遗传距离较近，独立于菲律宾、马来西亚和泰国类群分支外。

不同地区的卫氏并殖吸虫所寄生的适宜宿主亦有所差异。中国、日本和韩国等东亚地区的地理株多以短沟蜷(GenusSemisulcospiru)为第一中间宿主；而马来西亚和菲律宾株则多以川蜷螺(GenusBrotia)[6]为第一中间宿主。日本和台湾地区的卫氏并殖吸虫二倍体多以泽蟹(GenusGeothelphusa)为第二中间宿主，而该地区的三倍体则多以日本绒螯蟹(Eriocheirjaponicus)为第二中间宿主；中国东北的卫氏并殖吸虫二、三倍体均以喇蛄(GenusCambaroides)[40]为第二中间宿主，福建的卫氏并殖吸虫二、三倍体多以华溪蟹(GenusSinopotamon)[41]为第二中间宿主。猫、狗是卫氏并殖吸虫常见的终宿主，但马来西亚的卫氏并殖吸虫囊蚴感染猫和狗后，只有少数能发育为成虫，多数囊蚴则只能在宿主肌肉中发育到童虫期，若将其肌肉中的童虫重新投喂给其它猫或狗，方能继续发育，并可在终宿主肺部检获大量成虫[42]。啮齿动物通常仅作为卫氏并殖吸虫的转续宿主，但也有报道日本兵库县、千叶县和三重县的卫氏并殖吸虫能够在大鼠体内发育成熟[43]。

2.2种间交流 Doanh等[44]在越南广平省发现有大、小囊蚴共存的溪蟹，根据囊蚴形态，大囊蚴((700～790)μm×(680～780)μm)和小囊蚴((400～450)μm×(400～450)μm)分别被判定为哈氏并殖吸虫和曼谷并殖吸虫。由于该地首次发现哈氏并殖吸虫，特挑选哈氏并殖型大囊蚴感染猫，以收取成虫。作者除了获得典型的哈氏并殖型单生体棘的成虫外，还获得了丛生体棘的成虫。后者具有与曼谷并殖吸虫一致的CO1序列，但ITS2序列和28S rDNA R2区序列分析显示，该成虫为哈氏并殖吸虫和曼谷并殖吸虫的杂合体。提示哈氏与曼谷并殖吸虫之间存在自然杂交，曼谷并殖吸虫子代能够发育为哈氏并殖型大囊蚴。在其他吸虫中已经发现有种间杂交现象，如肝片吸虫属的大片吸虫(Fasciolagigantica)和肝片吸虫(Fasciolahepatica)、裂体吸虫属的牛血吸虫(Schistosomabovis)和埃及血吸虫(Schistosomahaematobium)，曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)和罗海因氏血吸虫(Schistosomarodhaini)等[45]。该研究为并殖吸虫属虫种间亦可能存在的种间杂交提供了证据。

3 卫氏并殖吸虫三倍体的研究

3.1三倍体的定种争论 卫氏并殖吸虫自然种群的染色体具有加倍现象，包括三倍体和四倍体。Sakaguchi[46]首次报道了卫氏并殖吸虫三倍体的存在，Miyazaki以受精囊有无精子和染色体组型为依据，将卫氏并殖吸虫二倍体作为基本型，特点是两性生殖，而三倍体为肺生并殖吸虫(P.pulmonalisBaelz, 1880)，特点是孤雌生殖、囊蚴、成虫和虫卵都比二倍体的大[21]。Agatsuma[47]比较了卫氏并殖吸虫在二倍体和三倍体间的15种酶的同工酶谱差异，发现其中5种酶谱在二倍型中表现为纯合子，在三倍型中表现为杂合子。结合Hirai[48]的染色体C带染色结果，即三倍体有两条染色体的带型与二倍体一致。因此，作者认为：卫氏并殖吸虫的三倍体应为独立虫种，并推测三倍体可能是二倍体偶然与其他近缘种杂交的后代。Saijuntha等[30]以TKD1int2为分子标记，对卫氏并殖吸虫的二倍体和三倍体进行了研究，亦认为三倍体为杂合子。此外，二倍体和三倍体在其他方面亦存在差异，如寄生于人体时，二倍体所导致的临床症状多为皮下游走性结节型，三倍体则主要为咳嗽、咳痰等肺型症状[49]；二倍体广泛分布于东南亚地区，而三倍体仅分布于中国、日本和朝鲜的少数地方[50]等。

Blair[28]使用ITS2与CO1序列对中国、日本、韩国、菲律宾、马来西亚和泰国等地的卫氏并殖吸虫样本进行聚类分析后，结果显示：卫氏并殖吸虫的二倍体和三倍体型相互混杂，无法形成明显独立的聚类，因此认为不宜将卫氏并殖吸虫三倍体作为独立的种。但由于无法解释两型虫种在形态、生殖方式和流行区分布上的种种差异，对于依据DNA序列的差异，把二倍体和三倍体归为同一物种的观点亦存在争议。今后的研究需要寻找和利用更具代表性的分子标记，以获得更丰富的遗传信息。

3.2三倍体地理起源的讨论 由于中国、日本和韩国都有三倍体的分布，这三地三倍体的来源和系统进化关系亦未知。Hirai和Agatsuma[51]比较了中国与日本多地区卫氏并殖吸虫的同工酶谱，认为日本的卫氏并殖吸虫三倍体起源于中国东北。Herwerden等[52]通过限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms, RFLP)和微卫星指纹技术对中国、日本和韩国等不同地域来源的卫氏并殖吸虫三倍体进行了研究，发现不同地域间卫氏并殖吸虫三倍体存在差异，因此认为不同地域的三倍体相互独立。Agatsuma等[53]对中国、中国台湾、日本、菲律宾等地的卫氏并殖吸虫二倍体、三倍体中线粒体的16S rDNA和一段非编码区序列进行分析。结果表明，16S rDNA序列有个体间变异，但并不能区分二倍体和三倍体；但所有地区三倍体样本的16S rDNA和非编码区序列均无变异，提示中、日、韩三地的卫氏并殖吸虫三倍体可能起源相同。

4 小 结

综上，并殖吸虫分布广泛，种类众多，作为模式种的卫氏并殖吸虫是亚洲最常见的虫种，其种群遗传多样性也远远高于已知的其他种，各地理种群呈现出不同程度的形态学、宿主适应性差异，尤其东亚地区与南亚地区的地理株差别较大。不同于卫氏并殖吸虫二倍体，新的分子标记显示三倍体为杂合子，支持了两型之间的异质性，并且暗示各地的三倍体种群可能都曾起源于一个地点。此外，新发现的哈氏并殖吸虫和曼谷并殖吸虫种间存在自然杂交的现象，丰富了人们对并殖吸虫种间关系的认知，但是同时也模糊了虫种之间的界限，使得分类更加困难。

以往对并殖吸虫的鉴定通常是先观察囊蚴或成虫的形态学特征作初步判别，而后再联合核基因组内转录间隔区2(ITS2)和线粒体细胞色素c氧化酶(CO1)等DNA分子标记进行系统发育分析加以验证，一般均可取得一致的结果。对于形态学和分子生物学结果相矛盾的情况，则需要寻找更具代表性的分子标记，以获得更丰富的遗传信息作为依据。尤其是卫氏并殖吸虫三倍体的澄清，应结合生活史、形态学和分子生物学多个角度判断。由于并殖吸虫种间种内形态特征变异较大，现有的分子标记无法清晰阐释某些虫种之间的差异。通过全基因组水平的分析，寻找更具代表性的遗传信息，运用于并殖吸虫的分类学和遗传进化的研究，以期望能够获得并殖吸虫更明晰的分类和遗传结构。

利益冲突：无