广西空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行病学调查＊

林 玫，周凌云，王鸣柳，廖和壮，黄 君，农志新，农良伟，梁大斌，权 怡，方锦嵩，张茂俊

2.大兴区CDC，南宁 532300；

3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206

弯曲菌是重要的食源性人兽共患病原菌，可引起动物腹泻、流产，以及人类急性肠炎、格林巴利综合征、反应性关节炎、Reiter’s综合征等多种疾病，其中引起人类致病最多见的是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌［1－2］，近年随着国内外学者对其研究的深入，越来越显示出其引起的腹泻所导致的日益加重的疾病负担［3］。为了解广西两种弯曲菌所引起腹泻的流行病学特点以及在健康人群和动物中的携带状态，为该病防治提供依据，我们于2008－2010年在广西崇左市大新县和南宁市开展了腹泻病人群、健康人群、重点人群和食品等调查，现将结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 流行病学调查

1.1.1 腹泻病例调查 2008年9月－2010年12月期间，在崇左市大新县的县人民医院、妇幼保健院、中医院、疾病预防控制中心门诊等4所医院、3所乡镇卫生院、3所个体诊所以及南宁市2所医院（广西妇幼保健院及南宁市第一人民医院），对就诊的符合感染性腹泻病例定义的患者进行个案调查和采样。共采集粪便标本677份分别送大新县疾病预防控制中心（以下简称大新县CDC）和广西疾病预防控制中心（以下简称广西CDC）实验室进行分离培养，大新县CDC所检出的阳性标本送至广西CDC实验室进行复核和进一步检测。

1.1.2 健康人群调查 2008年9月－2009年3月间，在大新县调查5岁以下健康人群共121名，按6－12月、1－2岁、2－5岁共分3个年龄组，每组分别采集了37、38、46名健康人群（半个月内未患过腹泻者）共121份粪便标本，送广西CDC实验室进行检测。

1.1.3 从业人员携带状况调查 2009年9月在大新县某养猪场随机采集猪饲养员粪便标本11份、食品公司屠宰厂职工粪便标本21份共32份粪便标本，送广西CDC实验室进行检测。

1.1.4 动物携带情况调查 2009年9月分别在大新县某养猪场、大新县某养鸡场、南宁市某养鸡场、南宁市某市场售活鸡摊位共随机采集猪粪便标本50份、鸡粪便标本105份，送广西CDC实验室进行检测。

1.2 实验室检测

1.2.1 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌分离培养 用棉拭子沾取粪便涂于CCDA平板，再用接种环划线分离培养。42℃微需氧培养48 h观察可疑菌落。初步鉴定：菌落形态为菌落灰色、扁平、湿润、有金属光泽，似可颖菌落，直径1～2 mm，边缘完整、发亮。如无可疑菌落可继续培养5～6 d。挑取可疑菌落，转划哥伦比亚血平板进行分纯，对血平板上的菌落，一是直接进行PCR检测；二是进行革兰染色镜检，如为革兰氏阴性菌，螺旋形，弯曲杆状，呈S形、海鸥状或逗点状，则接种API生化试剂条进行系统生化鉴定。研究中使用的阳性对照菌株—空肠、结肠弯曲菌标准菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠；以鼠伤寒沙门菌作为阴性对照菌株。1.2.2 PCR和脉冲场凝胶电泳分型

1.2.2.1 单管二重PCR鉴定空、结肠弯曲菌 空肠弯曲菌引物序列：jun1 5′－CATCTTCCCTAGTCAAGCCT－3′，jun2 5′－AAGATATGGCACTAGCAAGAC－3′；结肠弯曲菌引物序列：Col1 5′－AGGCAAGGGAGCCTTTAATC－3′，Col2 5′－TATCCTATCTACAAATTCGC－3′。取灭菌超纯水制备200μL菌悬液，将其置于干式恒温器上100℃加热10 min，然后于12 000 r/min离心10 min，取上清液分装Eppendorf管，作为扩增反应的DNA粗制模板。反应总体系为25μL，体系中含d NTP Mixtures各0.4 mmol/L，10×Buffer 2.5μL，Ta KaRa Taq1.25 U，引物各10μmol/L，细菌DNA粗制模板1μL。

PCR 循环参数：94℃预变性5 min，94℃1 min、59℃1 min、72℃1 min循环35次，72℃延伸5 min，然后取扩增产物5μL在1%琼脂糖凝胶上电泳，用Gel Doc XR凝胶成像系统照像。

1.2.2.2 脉冲场凝胶电泳分型方法按照Pulse Net China对空肠弯曲菌进行PFGE分子分型的快速标准实验室规程操作。

1.3 数据统计分析 采用Excel表格进行数据录入，用Epi info软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 检出的菌株及阳性率 从采集的985份检材中共培养分离到21株弯曲菌。经对以上菌株用空肠弯曲菌、结肠弯曲菌特异性引物进行PCR扩增，获得空肠弯曲菌11株、结肠弯曲菌10株。弯曲菌总的检出率为2.13%，其中空弯和结弯检出阳性率分别为1.12%和1.02%，两者差异无统计学意义（P＝1.000），见表1。

表1 各群组中弯曲菌检出总表Tab.1 Campylobacter positive rate in all groups

2.2 腹泻病例调查 对677例腹泻病人进行采样调查，弯曲菌阳性率为0.89%。其中空肠弯曲菌为0.74%，结肠弯曲菌为0.15%，二者差异无统计学意义（P＝0.219）。按年龄组分别为0～岁组1.19%、1～岁组0.66%、2～岁组0.00%、5～岁组1.56%、10～岁组0.00%、20～岁组4.08%、30～岁组0.00%、40～岁组0.00%、50～岁组0.00%、60～岁组0.00%。其中，0～岁组、1～岁组和20～岁组检出空肠弯曲菌，阳性率分别为1.19%、0.66%和4.08%；5～岁组检出结肠弯曲菌，阳性率为1.56%；按季节分，除冬季外，其余季节均检出阳性弯曲菌，检出阳性率分别为春季（3～5月）为1.16%、夏季（6～8月）为1.23%、秋季（9～11月）为0.62%，不同季节弯曲菌阳性率差异无统计学意义（χ2＝1.600，P＝0.659）。其中空肠弯曲菌在春、夏、秋三个季节均有检出，而结肠弯曲菌仅在春季检出。

2.2 健康人群调查 对121名5岁以下儿童进行调查和采样，结果表明总阳性率为8.26%，其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌阳性率分别为3.31%和4.96%，二者差异无统计学意义（P＝0.754）。其中，空肠弯曲菌以2岁以下检出率为高，结肠弯曲菌则在每个年龄段均有检出。不同年龄段弯曲菌检出率差异无统计学意义（χ2＝2.282，P＝0.319），见表2。

表2 健康人群粪便标本检出结果Tab.2 Detection result of Campylobacter in healthy population＇s stool samples

2.3 从业人员携带调查结果 本次调查共对养猪场和屠宰厂职工采集32份粪便标本，均未检出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。

2.4 动物携带调查 对采集105份鸡和50份猪粪便标本进行检测，结果表明弯曲菌检出阳性率为3.23%，其中空肠弯曲菌阳性率为1.29%，结肠弯曲菌阳性率1.94%，二者差异无统计学意义（P＝1.000）。鸡和猪的弯曲菌检出阳性率分别为2.86%和4.00%，二者差别无统计学意义（χ2＝0.142，P＝0.707），见表3。

表3 动物粪便标本检出结果Tab.3 The detection result of Campylobacter in animal’s stool samples

2.5 PCR结果 见图1。

图1 弯曲菌阳性参考株和21份菌株标本PCR扩增电泳结果注：上图泳道1、100bp Ladder Marker（最亮的条带为500 bp）；泳道2－22为21株分离到的菌株；泳道23为空弯、结弯阳性对照；泳道24为阴性对照鼠伤寒沙门菌；泳道25为以水为模板的空白对照。Fig.1 PCR results of the positive reference strains of C.jejuni and 21 tested strainsLane 1：DNA Marker；Lane 2－22：tested strains；Lane 23：Positive control；Lane 24－25：Negative controls

2.6 菌株分型结果

2.6.1 PFGE图谱 见图2。

2.6.2 PFGE图谱的聚类分析结果 对上述所得的PFGE图谱，我们用Bio Numerics软件进行了分析。结果表明4株空肠弯曲菌经Cluster分析后得到3个PFGE型。空肠弯曲菌K018与K020的PFGE型完全相同，聚类相似性系数100%；空肠弯曲菌K021与中国CDC传控所惠赠的空弯标株700819的PFGE型完全相同，空肠弯曲菌K018、K020与空弯K014的聚类相似性系数为82.35%，见图3。

图2 弯曲菌分离株的PFGE图注：上图中泳道1、5为标准菌株 H9812，泳道2、3、4为 K014、K018，K020；泳道 6、7 为 K021、空弯标株700819。Fig.2 PFGE result of tested strainsLane 1，5：H9812 Marker；Lane 2，3，4，6：C.jejuni K014，K018，K020，K021；Lane 7：Positive reference strains of C.jejuni

3 讨 论

据美国国家食品网的监测，弯曲菌是发病率最高的病原菌，是全球范围内胃肠炎的主要病因，其病例数已超过李斯特菌病、沙门菌病和志贺菌病，WHO已将弯曲菌肠炎列为最常见的肠道传染病之一［4］。本研究已证实在广西腹泻病人中已成为重要的病原菌之一。本次弯曲菌检出率偏低［5－6］，可能与基层医务人员粪便的采样质量、实验室人员的检测经验和检测条件有关，结果也可能在一定程度上受本研究样本量的影响。

图3 弯曲菌分离株PFGE图谱的聚类分析图Fig.3 Cluster analysis of tested strains

结果显示，空肠弯曲菌在2岁以下的健康人群与腹泻人群中检出率均高，春夏秋季均有空弯检出，以夏季为多，与文献报道相符［5－7］。本研究显示结弯在5岁以下的健康人群各年龄段与5～10岁组的腹泻人群中有检出，仅在春季检出。

弯曲菌是多种动物如禽类、牛、羊及狗的正常寄居菌，可长期向外界排菌，从而引起人类感染［8］，因此，接触和消费禽类等动物与流行有很大的关系。结果显示，鸡中空弯菌阳性率为1.29%，结弯菌阳性率为1.94%，在猪中没有检出空弯菌，仅检出结弯菌，阳性率为4%。提示我区动物中携带弯曲菌比较普遍，且流行呈现多样化。

近年来，PCR技术空肠弯曲菌检测中广泛应用［9］，本研究中，对外观可疑的菌落，一是直接应用PCR技术进行检测，二是应用常规的生化鉴定方法进行检测，结果表明，PCR技术用时3 h，常规的鉴定需要2～3 d，PCR技术可以大大的缩短鉴定时间且特异性高。提示在以后的工作中，我们可以考虑直接对粪便标本应用PCR技术来进行检测，这样将会更加显著的缩短检测时间。对于空肠弯曲菌的分子分型，PFGE仍为公认的方法［10］。PFGE检测的是整个细菌染色体上所有酶切位点的变化，从整体上反映不同菌株全部基因的相关性。本研究空肠弯曲菌K018（大新县腹泻病人粪便标本）与K020（南宁市腹泻病人粪便标本）的PFGE型完全相同，提示二者可能存在相同的感染源。

由于弯曲菌对生长条件要求苛刻，检测周期长，对人员的经验、水平要求较高，因而基层实验室通常不开展此项工作。广西每年的腹泻病例三十余万例，腹泻暴发疫情数十起，由于采样和实验条件以及检测经验等的原因，其中很可能有同源空肠弯曲菌引起事件被忽视。因此要加强对腹泻病人及外环境、动物等相关样品中空肠弯曲菌的流行病学监测。

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