陕西省市售鸡肉中金黄色葡萄球菌的毒力基因及其药敏检测＊

徐本锦，张伟松，王 新，杨保伟，席美丽，夏效东，孟江洪，李新平

2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌 712100

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的一种重要病原菌，有些菌株能产生多种外毒素（肠毒素、剥脱毒素、中毒休克毒素－1和杀白细胞素等），能够导致食物中毒或感染［1］。近年来，随着抗生素的广泛使用及滥用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在动物源性食品中的检测率不断提高［2－3］，这已成为公共关注的社会问题。

已有报道［3－4］市售鸡肉中携带“超耐药菌”MRSA（methicillin－resistantStaphylococcusaureus），而鸡肉在我国是第二大肉类消费品，鸡肉食品从加工、运输到销售的过程中很容易被金黄色葡萄球菌污染。目前，有关陕西省市售鸡肉中金黄色葡萄球菌的耐药性、毒素基因和MRSA的资料尚不多。本研究对陕西省市售鸡肉样本中分离的122株金黄色葡萄球菌进行药敏实验、毒素基因检测和MRSA流行分析，为我国鸡肉食品的安全评估提供理论依据，并为临床用药提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 培养基和主要试剂 LB营养琼脂，MH琼脂，购自陆桥技术责任有限公司；Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA marker、DL2000 DNA marker、引物，购自大连宝生物公司；琼脂糖（Agarose）购自Sigma公司；四环素、庆大霉素、头孢西丁、头孢哌酮、阿米卡星、万古霉素、苯唑西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素、环丙沙星、红霉素，阿莫西林/克拉维酸14种抗生素购自sigma公司；氯化钠购自西安化学试剂厂。

1.2 菌株与标准菌株 从陕西省524份市售鸡肉样本中分离鉴定的金黄色葡萄球菌122株，由本实验室保存；药敏试验所用标准菌株ATCC29213和ATCC25923由本实验室保存。

1.3 基因组DNA的提取 用棉签蘸取经纯化培养的细菌于LB琼脂上进行活化，用棉签将活化培养的细菌置于装有500μL蒸馏水的1.5 m L离心管中，混匀。加热煮沸20min后，13 000rpm离心10 min，取上清液，于－20℃冰箱中保存备用。

1.4 PCR扩增及引物设计 按照Zhang［5］等的报道执行mec A基因的引物合成和扩增条件，通过PCR扩增鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。按照王琴［6］等的报道执行pvl基因的引物合成和扩增条件。按照Peles［7］等的报道执行ses和tsst－1基因的引物合成和扩增条件。按照Noguchi等［8］的报道执行剥落毒素基因（eta和etb）的引物合成和扩增条件。以上引物均由大连宝生物公司合成，引物序列及片段长度见表1。

1.5 电泳PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为1%，利用标准大小的DNA Marker，观察电泳完成后的凝胶，并记录PCR扩增的结果。

1.6 药敏性检测 参照CLSI［9］推荐的琼脂稀释法执行14种抗生素的药敏试验。

2 结 果

2.1mec A基因和毒素基因检测 本研究对122株金黄色葡萄球菌进行mec A基因和毒素基因检测，结果见图1。4.92%（6/122）的菌株携带有mec A基因。59.84%（73/122）的菌株携带有毒素基因，其中携带两种以上毒素基因的检测率为23.77%（29/122）。pvl基因的检出率为25.41%（31/122），肠 毒 素 基 因 的 检 出 率 为 51.64% （63/122），其中含有传统肠毒素基因（sea－see）的检测率为17.21%（21/122），仅含有新型肠毒素基因（segsej）的检测率为34.43%（42/122），肠毒素基因中sej的检出率最高，达37.70%（46/122），其次是seh，为13.11%（16/122），sea、seb、sec和sed基因的检出率 分 别为 6.56% （8/122）、3.28% （4/122）、5.74%（7/122）和1.64%（2/122），所有鸡肉分离菌株中均未检测到see、seg、sei、ets和tsst－1基因。共检测到20种毒素基因型，其中最多基因型为sej（21.31%；26/122），其次是pvl（8.20%；10/122）。

表1 PCR扩增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in PCR

图1 122株金黄色葡萄球菌ets、tsst－1、pvl和ses毒素基因检测结果Fig.1 PCR detection of ets，tsst－1，pvl and ses genes from 122 S.aureus isolates

2.2 耐药性检测 对122株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果见表2。菌株对红霉素的耐药率最高（87.70%），耐药率较高的依次为甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（81.97%）、四环素（67.21%）、阿米卡星（59.02%）、环 丙 沙 星 （53.28%）、苯 唑 西 林（52.46%）和阿莫西林/克拉维酸（40.16%），对氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、头孢西丁和头孢哌酮的耐药率分别为32.79%、27.05%、20.49%、13.11%和2.46%，所有菌株均对万古霉素敏感。

表2 122株鸡肉样本金黄色葡萄球菌药敏结果Tab.2 Antimicrobial resistances among 122 S.aureus strains isolated from retail chicken

又对所有菌株的多重耐药状况进行了统计，结果见图2。122株金黄色葡萄球菌100.00%存在耐药，其中3.28% （4/122）的株菌对1种抗生素耐药，8.20% （10/122 ）的株 菌 对2种 抗 生 素 耐 药，13.11%（16/122）的株菌对3种抗生素耐药，22.95% （28/122 ）的 株 菌 对4种 抗 生 素 耐 药，14.75% （18/122）的 株 菌 对 5 种 抗 生 素 耐 药，6.56%（8/122）的株菌对6种抗生素耐药，31.15%（38/122）的株菌对7种或7种以上抗生素耐药，共产生72种耐药谱（未列出），多重耐药（≥3种抗生素）率达88.52%（108/122）。

图2 市售鸡肉样本中122株金黄色葡萄球菌的多重耐药状况Fig.2 Multidrug resistance（MDR）observation among 122 S.aureus isolates from retail chicken

3 讨 论

目 前，国 内 外 很 多 研 究 人 员［2，10－11］已 经 对 金 黄色葡萄球菌各类毒素基因（肠毒素基因，剥脱毒素基因以及中毒休克症毒素基因等）的流行与分布进行了报道，但其结果差异很大。本研究分离菌株携带毒素基因 （59.84%）与中国的报道［10］（63.00%）基本一致，而与美国［2］（84.9%）和韩国［11］（29.6%）的报道差别较大，说明不同国家和地区以及不同来源的食源性金黄色葡萄球菌，其毒素基因的流行情况存在一定的差异，但这些毒素基因携带率均较高，因此，应加强食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测，防止食物中毒事件的发生。

已有研究报道［1，12］食物中毒分离株携带较多的新型肠毒素基因，说明新型肠毒素基因的存在可能与食物中毒有关。本研究分离菌株也携带较多（34.43%）的新型肠毒素基因，表明陕西省鸡肉存在一定的安全隐患，因此，应加强鸡肉食品中新型肠毒素基因的检测。研究表明，全球95%的金黄色葡萄球食物中毒事件由经典肠毒素引起［13］，本研究分离菌株携带经典肠毒素基因也较多（17.21%），这进一步说明市售鸡肉存在一定的安全隐患，提示我们应加强鸡肉中金黄色葡萄球菌的检测，防止其肠毒素进入食物链。

杀 白 细 胞 素 （panton－valentine leukocidin，PVL）是金黄色葡萄球菌产生的外毒素，是重要的致病因子，能在儿童和成人患者中造成严重的坏死性肺炎和皮肤损害［14］。本研究分离菌株携带pvl基因 （25.41%）与国内王凤玲等［15］（29.7%）和张静等［16］（19.30%）报道的基本一致，而与国外 Gillet等［14］（4.5%）和 Udo等［17］（9%）报道的差别较大，提示鸡肉食品中pvl毒素基因的流行可能具有地域性，应加强鸡肉食品中金黄色葡萄球菌pvl基因的检测。

近年来，食源性金黄色葡萄球菌呈现出多重耐药［2，10］的特点，尤其是食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistantstaphylococcusanreusMRSA）的出现［17］，使得食源性金黄色葡萄球菌的耐药性问题成为公共关注的热点问题，然而，关于我国鸡肉源金黄色葡萄球菌耐药特征的报道并不多，，本研究结果显示，鸡肉源金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率最高（87.70%），其次为甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（81.97%）和四环素（67.21%），这一结果与 Pu等［2］和刘冬香等［18］等报道的食源性金黄色葡萄球菌的耐药情况存在一定的差异，如刘冬香等［18］报道中国动物源性食品中金黄色葡萄球菌耐药率依次为四环素（42.5%）、红霉素 （41.6%）和环丙沙星（2.7%）。而Pu等［2］报道美国零售肉中的金黄色葡萄球菌耐药率依次为四环素（67%）、红霉素（30%）、环丙沙星（13%）和庆大霉素（3%），说明不同国家和地区以及不同来源的食源性金黄色葡萄球菌，其耐药情况存在一定的差异，因此，应加强监管鸡肉生产过程中抗生素的使用，避免耐药菌株的产生。

自20世纪60年代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）被发现以来，MRSA的出现呈上升趋势［19］，本研究共检测到6株（4.92%）MRSA 菌株，且所有MRSA菌株不仅对多种抗生素耐药，而且还携带种类和数目较多的毒素基因，现已有食源性MRSA感染的报道［17］，因此，应加强鸡肉食品中MRSA菌株的检测，防止其进入到食物链中。

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