RG－14260与雷帕霉素联合给药对两株子宫内膜癌细胞的作用

邓守恒 喻雄杰 曹凤军 柯贤柱 陈 萍 石小燕

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北 十堰 442000)

子宫内膜癌是中老年妇女常见的恶性肿瘤之一，近年来，发病有年轻化趋势，但其发病机制仍不十分清楚。已知子宫内膜癌的发生、发展与一些信号通路的活性改变密切相关，其中主要包括表皮生长因子受体 (EGFR)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)两条信号通路。当前，抑制相关信号通路已成为肿瘤靶向治疗的热点，故本研究拟以人10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白类似物 (PTEN)表达不同的两株子宫内膜癌细胞株 (PTEN缺失的 Ishikawa细胞和 PTEN表达完整的HEC－1A细胞)为研究对象，采用特异性信号通路抑制剂对两株细胞中EGFR及mTOR两条通路进行干预，探讨不同PTEN状态下两条信号通路在子宫内膜癌发生发展中的可能作用，为进一步阐明发病机制，合理选择抗肿瘤药物提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 药品试剂与仪器 表皮生长因子(EGF)、噻唑喃(MTT)、碘化丙啶(PI)为Sigma产品;EGFR抑制剂RG－14620(RG)、mTOR抑制剂雷帕霉素(RA)购自美国Biomol公司;兔抗人pAKT及β－actin单抗及山羊抗兔的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL发光液购于Pierce公司;其他试剂均为进口分装分析纯;Mod 550型全自动酶标仪(美国Bio－Rad公司);Epics Elite ESP型流式细胞仪(美国Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 两株子宫内膜癌细胞株(Ishikawa和HEC－1A)由本院临床医学研究所提供，培养于含10%小牛血清的DMEM培养基内，于37℃、饱和湿度，5%CO2条件下培养。两株细胞分别经EGF预处理2 h，并分别给予10 μmol/L RG、10 μmol/L RA、10 μmol/L+10 μmol/L RA，另设空白对照细胞(未给予任何信号通路抑制剂)。

1.2.2 单独及联合给药对细胞的抑制作用经不同抑制剂处理24 h后的各种细胞以1×104个/ml接种至96孔板，每孔100 μl，每组设3个复孔，培养24 h后每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，作用 2 h 后弃去上清液，150 μl二甲基亚砜作用 30 min，上全自动酶标液在570 nm波长下读取各孔吸光度A值，计算细胞抑制率。细胞抑制率=(对照组吸光度－药物组吸光度)/对照组吸光度×100%。

1.2.3 流式法检测细胞周期及凋亡 收集消化经不同抑制剂处理24 h后的各组细胞，0.01 mol/L PBS0.5 ml重悬细胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入 PI(终浓度为50 μl/ml)和RNA酶(终浓度为0.25 mg/ml)，室温下避光孵育30 min后流式细胞仪作DNA分析，以ModFit LT软件分析，拟合计算各时相细胞的百分比。

1.2.4 Western印迹法检测pAKT表达量 收集经不同抑制剂处理24 h后的各组细胞，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，即为细胞总蛋白，进行蛋白定量，调节每份样品蛋白浓度，加等量蛋白于上样缓冲液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，依次加入pAKT一抗和二抗，加入底物液显色，拍照。蛋白条带用Quanti Scan软件进行密度扫描分析。

1.3 统计学分析 以金氏公式〔1〕q=E(a+b)/〔(Ea+Eb)－Ea×Eb〕评价药物合用对体外细胞毒是否有协同作用:E(a+b)为合用抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率。分子为实测合并效应，分母为期望合并效应，q=0.85～1.15为单独相加(+)，q=1.15～2.0为增强()，q＞2.0为明显增强()，q＜0.85～0.55为拮抗(－)，q＜0.55为明显拮抗(－－)。数据以±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。

2 结果

2.1 联合给药对细胞增殖的抑制作用 10 μmol/L RG和10 μmol/L RA对PTEN表达阳性的HEC－1A细胞增殖抑制率分别为29.1%和28.3%，二者合用，则抑制率提高至41.6%，合用产生的抑制率大于两药单独使用，q值为0.85，表明两药合用产生的作用仅勉强达到两药单独相加，未产生协同效果。10 μmol/L RG和10 μmol/L RA对 PTEN表达阴性的 Ishikawa细胞增殖抑制率分别为44.5%和40.7%，二者合用，则抑制率提高至77.1%，合用产生抑制率大于两药单独使用，q值为1.17，表明两药合用产生的作用远大于两药单独相加，产生协同效果。两种细胞株比较，Ishikawa细胞对信号通路抑制剂作用更为敏感(表1)。

2.2 两株子宫内膜癌细胞凋亡率和细胞周期分布的比较 从表2可见，经RG和RA两种信号通路抑制剂作用后，Ishikawa细胞凋亡率明显高于HEC－1A细胞，尤其以二药合用后效果更为明显。经抑制剂作用后，Ishikawa细胞G1期细胞比例明显升高，S期细胞比例明显降低，尤其以RG和RA合用后效果更为明显(P＜0.01)，HEC－1A细胞也有上述变化趋势，但效果不如Ishikawa细胞显著(P＞0.05)。

2.3 Western印迹检测两株子宫内膜癌细胞中pAKT蛋白的表达 从图1中可见，Ishikawa细胞中pAKT表达量较高(灰度值为0.667±0.021)，而经RA和RG单独或联合作用24 h后，pAKT表达量明显减少(灰度值分别为 0.421±0.076和0.407±0.059，P＜0.05)，尤其以二药联合作用效果最为明显(灰度值为0.326±0.046，P ＜0.01)。相比之下，HEC－1A 细胞中pAKT表达量则较低，经二药单独或联合作用后，pAKT表达量变化则不明显。

表1 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用(n=4)

表2 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞凋亡率和细胞周期分布影响(n=4)

图1 两株子宫内膜癌细胞中pAKT蛋白的变化

3 讨论

人类肿瘤的发生是多种基因共同作用的结果，癌基因的激活和抑癌基因的失活或突变是其发生、浸润和转移的主要分子基础。EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，基因扩增引起的EGFR过表达从而激活下游的PI3K/AKT/mTOR或(和)MAPK信号通路是许多人类肿瘤的特征之一〔2，3〕。

将一种抗EGFR抑制剂与其他分子靶向治疗相结合正成为抗肿瘤治疗的研究热点，原因在于，其一，一种肿瘤不太可能只依赖于一种受体或是一条信号转导通路来维持其自身的生长和生存。其二，在信号网络中不同受体之间存在相当程度的代偿性信号通路。将抗EGFR受体治疗与抗Ras疗法〔4〕或是针对Ras下游分子如Raf/MEK/MAPK的治疗结合已经成为可能。同时，越来越多的证据也证实了抗EGFR受体治疗与阻断其下游PI3K/Akt/mTOR通路的药物联合应用的合理性和可行性〔5，6〕。

笔者将EGFR和mTOR抑制剂单独和联合作用于两株不同子宫内膜癌细胞，发现Ishikawa细胞对抑制剂作用敏感，表现为细胞抑制率和凋亡率高，S期细胞数量明显减少，两药合用效果呈协同作用。而HEC－1A细胞则不敏感，这与Steelman等人研究结果相一致〔7〕，可能是由于两株细胞中存在着PTEN基因的不同表达所致，该基因表达的PTEN蛋白定位于胞浆，由403个氨基酸组成，可通过双重磷酸酯酶活性负性调控三条途径:PI3K/AKT/mTOR途径、FAK途径、MAPK途径来调节细胞生长、增殖、凋亡、细胞迁移、血管生长等。Ishikawa细胞中由于缺乏PTEN蛋白，使得下游PI3K/AKT/mTOR呈一种慢性激活状态，表达为pAKT数量较高，经抑制剂作用后，pAKT数量又很快降低，而HEC－1A细胞中则看不到这些现象，提示PTEN状态还与子宫内膜癌细胞对相关信号通路抑制剂的敏感性相关，PTEN基因的表达水平可成为预测相关信号通路抑制剂敏感与否的标志物之一，这为合理选择化疗方案提供了一个标志。

1 戴体俊.合并用药的定量分析〔J〕.中国药理学通报，1998;14(5):479－51.

2 Ohgaki H.Genetic pathways to glioblastoma〔J〕.Neuropathology，2005;25(1):1－7.

3 Sunpaweravong P，Sunpaweravong S，Puttawibul P，et al.Epidermal growth factor receptor and cyclin D1 are independently amplified and overexpressed in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2005;131(2):111－9.

4 Tabernero J，Rojo F，Marimón I，et al.A phase Ⅰ pharmacokinetic and pharmacodynamic study of weekly 1－hour and 24－hour infusion BMS－214662，a farnesyltransferase inhibitor，in patients with advanced solid tumors〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(10):2521－33.

5 Costz LJ，Gemmill RM，Drabkin HA.Upstream signaling inhibition enhances Rapamycin effect on growth of kidney cancer cells〔J〕.Urology，2007;69(3):596－602.

6 Buck E，Eyzaguirre A，Brown E，et al.Rapamycin synergizes with the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in non－small－cell lung，pancreatic colon，and breast tumors〔J〕.Mol Cancer Ther，2006;5(11):2676－84.

7 Steelman LS，Navolanic PM，Sokolosky ML，et al.Suppression of PTEN function increases breast cancer chemotherapeutic drug resistance while conferring sensitivity to mTOR inhibitors〔J〕.Oncogene，2008;27(2):4086－95.