结核性胸膜炎患者胸液中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞抑制抗结核免疫

胡良安 王晓虹 刘金华 罗永艾

(重庆医科大学附属第一医院肺科，重庆 400016)

CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞，也称CD4+CD25+调节T 细胞产生于胸腺，它主要作用是抑制逃避了其他耐受机制的自身反应T细胞的活化及功能〔1〕，这样使机体保持自身耐受，防止自身免疫性疾病的产生，但这也削弱了机体对感染的病原菌的免疫抑制反应。决定结核菌感染呈慢性化的因素和结核特异免疫反应被抑制的原因目前不清楚。然而，在人类包括巨细胞病毒、HBV、HCV、HIV在内的慢性感染中发现，CD4+CD25+调节T细胞在免疫抑制中起重要作用〔2〕，我们推测这些调节细胞在结核病的特异免疫中也可能起抑制作用。因为结核性胸膜炎的抗结核免疫反应局限在胸膜腔中，所以结核胸膜炎是研究体内病灶局部免疫反应的理想模型，因此我们研究结核胸膜炎患者胸液中是否有CD4+CD25+调节T细胞存在，及其是否有调节免疫功能。

1 对象与方法

1.1 研究对象的选择及实验样本的获取 研究对象符合病理，或临床、X线及后继的抗结核治疗有效的结核性胸膜炎患者15例，年龄21～58岁，平均37.5岁，男6例，女9例，胸膜活检诊断结核及抗痨治疗有效12例，临床表现、X线表现及抗痨治疗有效3例，PPD阳性14例，PPD阴性1例，BCG接种史15例。排除患乙肝、丙肝、HIV、肿瘤、糖尿病、甲亢、哮喘、自身免疫性疾病的患者，以及使用影响机体免疫功能药物者。结核性胸膜炎患者15例，在治疗前获取研究样本;选择年龄、性别与患者无差异的健康人作正常对照者17例，年龄24～46岁，平均32.6岁，男8例，女9例，PPD阳性17例，BCG接触史17例。研究对象都在医院伦理委员会制定的参与该实验知情同意书上签名，同意参加该实验。从研究对象获取外周静脉血25 ml，结核性胸膜炎患者同时抽取胸液50～200 ml。

1.2 细胞分离 用Ficoll-Hypaque密透离心法分离抗凝外周血得外周血单核细胞(PBMCs);使用胸液液体50～200 ml，离心获得胸液单核细胞(PFMCs)。获得的血浆及胸液离心后的上清液-70℃贮存用于检测干扰素(INF)-γ。这些单核细胞用CD4阴性选择磁珠分离获得CD4+细胞，剩余细胞为CD4-细胞;再用CD25阳性选择磁珠分离CD4+细胞获得CD4+CD25+细胞，剩余为CD4+CD25-细胞。获得的CD4-和CD4+CD25-作为去除调节T细胞的淋巴细胞贮存备用。磁珠分离按试剂盒(德国Miltenyi Biotech公司)说明书操作。

1.3 流式细胞分析 对上述分离的各种细胞用流式细胞分析:FITC-anti-CD4，PE-anti-CD8，CY5-anti-CD3(法国 Immunotech公司)三种荧光抗体染色30 min后(使用FIFC-鼠IgG1，PE-鼠IgG1，CY5-鼠IgG作同型对照)，再用 CY5-antiCD4(法国 Immunotech公司)，FITC-anti-CD25(美国 Ebioscience产品)，PE-anti-FOXP3(美国Ebioscience产品)染色(操作按说明书进行)(用同型相应抗体作对照)。1%多聚甲醛固定细胞后用流式细胞分析仪检测标本。

通过流式细胞分析可以检测经细胞分离所得上述各种细胞的纯度，CD4+CD25+细胞用于 FOXP3的表达分析，CD4+CD25+FOXP3+细胞占CD4+CD25+细胞或CD4+细胞或混合淋巴细胞的百分比在各组中作比较。

1.4 细胞增殖实验 取病人及正常人的2×104新鲜分离的PBMCS或去调节T细胞的PBMCS放于96孔板10%胎牛血清的1640培养基200μl中，同时再加入10μg/ml BCG，各一式三份。培养72 h后吸出100μl上清液作IFN-γ检测。胸液单核细胞增殖实验方法与上述相同。

1.5 细胞抑制实验 取细胞分离获得的CD4+CD25-细胞(2×104/孔)加入96孔细胞培养板中作为效应细胞，在没有或有不同数量的CD4+CD25+细胞条件下，再加入10μg/ml BCG，各一式三份。加入1×105经过丝裂霉素(美国Sigma公司)处理的单核细胞培养5 d，取上清液测INF-γ。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，数据以x±s表示，使用方差分析、t检验判断相差的显著性。

2 结果

2.1 CD4+CD25+FOXP3+细胞占CD4+细胞总数百分比 结核胸膜炎患者胸液CD4+CD25+FOXP3+细胞数占CD4+细胞总数的百分比显著高于结核胸膜炎患者自身外周血(P＜0.05)及正常人外周血(P＜0.01)，结核胸膜炎病人外周血CD4+CD25+FOXP3+细胞数占CD4+细胞总数的百分比显著高于正常人(P＜0.01)(如表1);同时结核胸膜炎患者胸液CD4+CD25+FOXP3+细胞数占淋巴细胞总数的百分比显著高于结核胸膜炎患者自身外周血(P＜0.01)及正常人外周血(P＜0.01)，结核胸膜炎病人外周血CD4+CD25+FOXP3+细胞数占淋巴细胞总数的百分比显著高于正常人(P＜0.01)。见表1。

表1 结核胸膜炎患者CD4+CD25+FOXP3+细胞数增多(x±s)

2.2 外周血白细胞对BCG的刺激反应 病人胸液(P＜0.05)及外周血白细胞对BCG抗原刺激后产生IFN-γ的能力比对照人群外周血白细胞明显增强〔(1 119±555.3)，(884.5±319.5)vs(500.7±176.3)pg/ml，P ＜0.05〕;且病人胸液比外周血白细胞对BCG抗原刺激后产生IFN-γ的能力也明显增强(P＜0.05)。

2.3 除去CD4+CD25+细胞IFN-γ的水平 在BCG的刺激条件下，除去CD4+CD25+细胞的结核性胸膜炎病人(10个病人)胸液单核细胞和外周血单核细胞产生IFN-γ显著增强(P＜0.05)，而不能对正常人(7例)除去CD4+CD25+细胞后的外周血白细胞有促进作用。见表2。

2.4 抑制实验 从结核性胸膜炎病人胸液PFMCs(5个病人)及外周血PBMCs(8个病人)中分离CD4+CD25+细胞和CD4+CD25-细胞。用5×104数目的CD4+CD25-细胞与同一个体相同样本(胸液或外周血)分离的CD4+CD25+细胞以不同比例共同培养时，用BCG刺激，检测细胞培养上清液中IFN-γ的浓度。结果见图1，细胞培养上清液中IFN-γ的浓度随CD4+CD25+细胞数量的减少而增加(P＜0.01);而且胸液CD4+CD25+细胞比外周血CD4+CD25+细胞抑制CD4+CD25-细胞产生IFN-γ的 作用更强(P＜0.01)。抑制作用更强(比病人外周血中CD4+CD25+细胞)。CD4+CD25+细胞抑制结核特异细胞免疫力，在体内可能对结核细胞免疫也有抑制功能。结核性胸膜炎病人胸膜腔CD4+CD25+细胞的增多提示免疫反应在炎症组织中增强了，因此，虽然我们观察到病灶组织CD4+CD25+细胞数量增多，活性增强，但病灶组织中仍然存在炎症，这说明在结核胸膜炎中，免疫抑制不能完全阻止胸膜腔的免疫病理反应。

表2 除去CD4+CD25+FOXP3+细胞后，患者单个核细胞产生IFN-γ的能力增强(x±s)

图1 抑制实验

3 讨论

研究提示结核病灶局部的调节T细胞增高，然而，因病例数太少，与正常人比较无显著差异〔3〕，另有报道也提示肺结核病人肺病灶组织中调节T细胞量比外周血中高〔4〕。

我们研究发现:结核胸膜炎胸液中CD4+CD25+细胞占总的CD4+细胞或总的淋巴细胞的百分比明显高于结核患者自身外周血和正常人外周血中CD4+CD25+细胞，结核患者外周血中CD4+CD25+细胞占总的CD4+细胞或总的淋巴细胞的百分比也高于正常人外周血中CD4+CD25+细胞，与以前的研究一致〔5，6〕。这进一步坚定了CD4+CD25+调节细胞聚积在结核菌感染病灶的局部，然而不能肯定这些调节细胞是局部增殖或是从血中渗出增加的结果，但我们推测胸液中CD4+CD25+细胞的增加可能是由于细胞募集，因为已证明人体CD4+CD25+细胞可移动集聚到腹水中，但很少进入引流淋巴结，CCL22起介导作用〔7，8〕。

本研究表明从结核性胸膜炎病人胸液单核细胞和病人外周血单核细胞中除去CD4+CD25+细胞后，这些剩余单核细胞对BCG刺激产生IFN-γ的能力明显增强了，但是来自正常人群的外周血单核细胞无这些作用，这间接证明了结核性胸膜炎病人CD4+CD25+细胞抑制增殖反应。胸液中CD4+CD25+细胞

1 Shi HZ，Qin XJ.CD4+CD25+regulatory T lymphocytes in allergy and asthma〔J〕.Allergy，2005;60(6):986-95.

2 Kinter AL，Hennessey M，Bell A，et al.CD25(+)CD4(+)regulatory T cells from the peripheral blood of asymptomatic HIV-infected individuals regulate CD4(+)and CD8(+)HIV-specific T cells immune responses in vitro and are associated with favorable clinical markers of disease status〔J〕.JExp Med，2009;200(3):331-43.

3 Guyot-Revol V，Innes JA，Hackforth S，et al.Regulatory T cells are expanded in blood and disease sites in patients with tuberculosis〔J〕.Am J Bespir Crit Care Med，2006;173(7):803-10.

4 Ribeiro-Rodrigues R，Resende CT，Rojas R，et al.A role for CD4+CD25+T cells in regulation of the immune response during human tuberculosis〔J〕.Clin Exp Immunol，2006;144(1):25-34.

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6 He XY，Xiao L，Chen HB，et al.T regulatory cells and Th1/Th2 cytokines in peripheral blood from tuberculosis patients〔J〕.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010;29(6):643-50.

7 Curiel TJ，Coukos G，Zou L，et al.Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival〔J〕.Nat Med，2004;10(8):942-9.

8 Wu C，Zhou Q，Qin XJ，et al.CCL22 is involved ni the recruitment of CD4CD25 high T cells into tuberculosis pleural effusions〔J〕.Respirology，2010;15(3):522-9.