三七总皂苷对肝癌高转移细胞HCCLM3的抑制作用研究＊

陈 鹏，王志萍，李 文，胡明道

（昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明 650101）

原发性肝癌是我国男、女性因恶性肿瘤致死的第二和三位原因，五年生存率仅5%左右。究其原因，一是很多肝癌病人在诊断后肿瘤已不能切除；此外肝癌切除术后的转移复发率高达60～80%。但目前尚缺少一种有效的方法预防肝癌术后复发转移，肝细胞癌对大多数抗癌药物敏感性差，传统的化疗药物毒副作用大，疗效不理想。因此寻找一种低毒副作用药物能抑制肝癌术后复发转移显得很有意义。三七总皂苷是中药三七的主要药物成分，具有低毒副作用的特点，本文应用不同浓度三七总皂苷作用于高转移性的人肝细胞肝癌细胞系HCCLM3，观察对肝癌高转移细胞增殖和形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 高转移性的人肝细胞肝癌细胞系HCCLM3购买于复旦大学附属中山医院肝癌研究所。

1.1.2 药物及试剂 三七总皂苷（从五加科人参属多年生草本植物三七中提取的有效成分）购自昆明制药集团股份有限公司，二苯基四氮唑溴盐（MTT）为美国sigma公司产品，二甲基亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养 HCCLM3细胞用含15%新生胎牛血清的高糖DMEM完全培养基于37℃、5%CO2、混合气体的孵箱（95%饱和湿度）内培养。每2天换液1次。细胞单层贴壁生长，待长满瓶底时，用胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，继续传代。

1.2.2 MTT法测定细胞存活率 取对数生长期细胞，以4×103个／孔浓度接种于96孔板，每孔含100μl细胞悬液。每组设3个平行孔，并设空白对照。贴壁培养24h后，换含有终浓度为25、50、100、200、400mg／L三七总皂苷培养液继续培养，对照组培养液仅含0.04%DMSO。分别培养24h、48h及72h后取出培养板，并加入20ul／孔的MTT继续培养。3h后，吸尽每孔中的液体，加入二甲基亚砜150μl／孔，在震荡器上震荡5min，使结晶物充分溶解。在全自动酶标读数仪上分别测定570nm波长处不同时间（24h、48h、72h）、不同药物浓度下的吸光度值（A570），并计算细胞的存活率。存活率＝药物组A570／对照组A570×100%。

1.2.3 一般形态观察 将对数生长期的HCCLM3细胞消化，计数、调整浓度为3×105／mL，接种于6孔板中，1.0mL／孔，再加入高糖DMEM完全培养基1.5mL。待24h细胞贴壁开始生长后，换液并加入含0.04%DMSO（对照组）及200mg／L的三七总皂苷培养液，处理48h后于倒置显微镜下观察细胞密度和细胞形态的变化并照相。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度三七总皂苷不同时间对 HCCLM3细胞增殖的影响 由以下表1可见不同浓度（25～400mg／L）的三七总皂苷处理HCCLM3细胞24～72h后，出现对细胞增殖不同程度的抑制作用。其中处理48h后三七总皂苷作用开始明显，且具有明显浓度依赖性，随浓度增加抑制作用更明显。从24～48h，三七总皂苷的作用具有时间依赖性，随时间延长，作用更明显，结果见表1。

表1 三七总皂苷对HCCLM3细胞存活率的影响（±s，%）

表1 三七总皂苷对HCCLM3细胞存活率的影响（±s，%）

同一时间治疗组均数与对照组相比，＊P＜0.05；同一时间与上一组浓度相比，△P＜0.05；同一浓度与上一组时间相比，▲P＜0.05

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2.2 倒置显微镜下观察三七总皂苷对HCCLM3细胞生长和形态的影响 置显微镜下HCCLM3细胞为多边形上皮样细胞，成单层生长，细胞间相互连接，胞浆丰富，胞核大而圆。经200mg／L的三七总皂苷处理48h后细胞密度降低，细胞相互分离，部分细胞脱落呈悬浮状，并见细胞碎片。（见图1）

3 讨论

肿瘤所体现的各种恶性生物学行为是由单个肿瘤细胞来行使的，欲在这个层次上开展工作需要有一个适宜的研究对象－肝癌细胞系。本实验采用复旦大学肝癌研究所建立的高转移细胞系HCCLM3。该细胞能够合成并分泌甲胎蛋白、白蛋白并细胞角质蛋白8阳性，具备肝癌细胞特点；用该细胞瘤组织原位接种于裸鼠肝脏，5周后腹壁转移100%、腹腔内转移80%、肝内转移100%、膈肌转移70%、肺转移100%，具有良好的自发性转移特性［1］。

中药三七主要功用为化瘀止血，消肿止痛，目前也有三七提取物用于治疗肿瘤的研究［2～4］。三七总皂苷是中药三七的主要药物成分。笔者的实验以肝癌高转移细胞为研究对象，研究发现三七总皂苷对肝癌高转移细胞HCCLM3增殖具有抑制作用，并呈时间和剂量依赖关系。通过倒置显微镜观察也发现200mg／L的三七总皂苷作用48h后贴壁细胞密度降低，细胞脱落死亡。

肝癌术后较高的转移复发率是进一步改善肝癌预后的重大障碍。但目前尚缺少一种有效的方法预防肝癌术后复发转移。云南省是三七的主要产地，三七具有低毒副作用的特点，开发三七的作为预防肝癌术后复发转移的辅助药物具有良好的临床应用前景和重大的社会和经济价值。笔者的研究发现三七提取物三七总皂苷对肝癌高转移细胞具有抑制作用，作用机制尚待于进一步研究。

［1］李雁，汤钊猷，叶胜龙，等 .体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系［J］.中华医学杂志，2002，82（9）：601～605.

［2］张志信，黄保贵，张仕秀，等 .三七茎叶总黄酮对SMMC－7721细胞增殖的影响［J］.云南中医中药杂志，2006，27（6）：37～38.

［3］王志斌，李军祥，朱陵群，等 .三七提取物对 GES－1细胞及MNNG转化后GES－1细胞增殖的抑制作用［J］.中西医结合学报，2004，2（6）：445～448.

［4］杨芬，刘浩，余美玲，等 .三七粉对小鼠S180移植肿瘤的抑制作用及免疫能力的影响［J］.蚌埠医学院学报，2009，34（3）：195～197.