药用真菌桑黄的液体发酵培养基的配方优化筛选研究

2012-08-01傅海庆傅华英

江西农业大学学报 2012年5期

傅海庆，周阳，傅华英

(1．福建农林大学金山学院，福建福州 350002;2．福建农林大学作物学院，福建福州 350002)

桑黄(Phellinus igniarius)是一种珍贵的药用真菌，也是目前国际公认的抗肿瘤效果最好的药用真菌之一［1－3］。它含有多糖、黄酮、麦角甾醇、香豆素、多肽等多种药理成分，其中的多糖具有提高免疫力、抗癌、抗肿瘤、抗肝纤维化、抗菌、抗诱变、降低血糖等多方面功能［4－13］。因此，桑黄已经成为国内外保健品行业与医药制剂研究与开发的热点之一，市场前景非常广阔［14－15］。但是，我国桑黄野生资源匮乏，采用固料栽培的方法不仅产量低，而且生长期很长，这些严重制约了桑黄产业的发展。所以对于桑黄菌液体发酵的研究，使其获得大量的菌丝体具有十分重要的意义。本文探讨了桑黄菌液体发酵的培养基配方优化筛选，为进一步研究桑黄液体发酵工艺提供有益试验数据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种桑黄菌种由福建省食用菌种质资源保藏管理中心提供，编号为ph．I0001。

1．1．2 原料黄豆、土豆、玉米粉，均从普通市场购得。

1．1．3 主要试剂酵母提取粉、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、葡萄糖、琼脂为生化试剂，维生素B1为医药品，其它试剂均为分析纯。

1．1．4 供试培养基斜面培养基用马铃薯琼脂培养基(PDA);摇瓶液体种子培养基配方(g/L):玉米粉40、黄豆粉 20、KH2PO44、MgSO42、VB10．1、pH 自然。

1．1．5 主要仪器设备立式压力蒸汽灭菌器、LP1002B电子天平、净化工作台、可调速旋转式摇床、生物显微镜、DHG－9240A型恒温鼓风干燥箱等。

1．2 方法

1．2．1 菌种培养 (1)菌种的固体斜面培养:将桑黄菌种接种在固体斜面马铃薯培养基(PDA)上，置于28℃培养箱中培养至菌丝长满斜面为止，冷藏备用。

(2)摇瓶液体种子培养液培养:在250 mL三角瓶中装量100 mL培养液，一级种子接入约1．5 cm2的斜面菌种2块，二级发酵是按体积分数为10%接种量接入种子培养液，在28℃温度下以转速135 r/min旋转式摇床培养5 d而得。

1．2．2 单因素试验设计及试验方法 (1)液体发酵碳源的试验。碳源试验中选择了葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉等5种常见的原料作为碳源，分别替换液体种子培养基中的玉米粉，并按20 g/L加入量组成新配方进行培养试验，研究不同碳源对桑黄菌丝体生长的影响，从而可筛选出适合桑黄菌生长的最佳碳源。并进一步针对最佳碳源，选取其加入浓度分别为5，10，15，20，30，40 g/L组成配方进行试验，培养5 d后分别测定所获桑黄菌丝体的干质量，筛选出最适浓度。

(2)液体发酵氮源的试验。氮源试验选择了硫酸铵、酵母提取粉、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉等5种常见的原料作为氮源，分别替换液体种子培养基中的黄豆粉，并按20 g/L加入量组成新配方进行培养试验，研究不同氮源对桑黄菌丝体生长的影响，从而可筛选出适合桑黄菌生长的最佳氮源。并进一步针对最佳氮源，选取其加入浓度分别为5，10，15，20，30，40 g/L组成配方进行试验，培养5 d后分别测定所获桑黄菌丝体干质量，筛选出最适浓度。

(3)液体发酵无机盐的试验。药用菌的生长发育还需要适量的矿物质元素，这些矿物质元素参与细胞结构物质的组成、酶的组成、调节细胞渗透压等。本试验选择了5种不同无机盐，即NaCl、CaCl2、KCl、Na2CO3、Ca(NO3)2，分别按2．0 g/L添加到摇瓶液体种子培养基中形成不同的配方进行培养试验，考察不同无机盐对桑黄菌丝体生长的影响。并进一步针对最佳无机盐，选取其加入浓度分别为1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5 g/L组成配方进行试验，培养5 d后分别测定所获桑黄菌丝体干质量，筛选出最适浓度。1．2．3 多因素试验设计和试验方法在单因素试验的基础上，分别选取玉米粉作为碳源、黄豆粉作为氮源、氯化钾作为无机盐作三因素三水平的L9(34)正交试验，以分别添加KH2PO44．0 g/L、MgSO42．0 g/L、VB10．1 g/L为固定因子。共9个组合，以菌丝体干质量为指标，培养7 d后测定菌丝体干质量，以确定各因素对桑黄菌丝体干质量的影响，优化筛选桑黄摇瓶发酵培养基的较优配方。

1．2．4 菌丝干质量的测定方法用20目的标准检验筛过滤菌丝，并用清水洗涤2～3次，放于60℃恒温干燥箱中烘干，称量其干质量，计算公式如下:

2 结果与分析

2．1 单因素试验结果

2．1．1 不同碳源种类及浓度对桑黄菌丝产量的影响经实验测得各碳源对应的菌丝产量如图1所示，可以看出不同的碳源种类获得的菌丝产量是不同的，以玉米粉为碳源时获得的菌丝产量最高，桑黄菌丝体干质量为 0．78 g/100 mL，因此确定它为最佳碳源。

进一步以玉米粉做梯度试验结果如图2所示。结果表明，培养基中添加玉米粉质量浓度为5～30 g/L时，菌丝体干质量呈上升趋势;当添加质量浓度大于30 g/L时，菌丝体干质量开始下降;故添加质量浓度为30 g/L时其菌丝体产量最大，为0．67 g/100 mL。因此，确定玉米粉的最佳添加量为30 g/L。

2．1．2 不同氮源种类及浓度对桑黄菌丝产量的影响经实验测得各氮源对应的菌丝产量如图3所示。可以看出不同的氮源得到的菌丝体产量也不同，使用酵母提取粉和黄豆粉所获得的菌丝体产量较大，两者并无显著差异，若是大批量生产，可考虑使用黄豆粉更经济。因此，可选择黄豆粉为最佳氮源。

进一步以黄豆粉做梯度试验结果如图4所示。当培养基中黄豆粉添加量为5～15 g/L时，桑黄菌丝体干质量呈上升趋势;当添加量大于15 g/L时，其干质量开始下降;故添加量为15 g/L时，获得菌丝体干质量最大，为 0．34 g/L。因此，确定黄豆粉的添加量应为15 g/L。

2．1．3 不同无机盐种类及浓度对桑黄菌丝产量的影响经实验测得各无机盐对应的菌丝产量如图5所示。添加不同的无机盐所得到的菌丝干质量是不同的，其中以添加氯化钾所得到的干菌丝产量最高。

图1 不同碳源对菌丝干质量的影响Fig．1 Effect of carbon source on the mycelium dry weight

图2 玉米粉对菌丝干质量的影响Fig．2 Effect of corn flour on the mycelium dry weight

图3 不同氮源对菌丝干质量的影响Fig．3 Effect of nitrogen source on the mycelium dry weight

图4 黄豆粉对菌丝干质量的影响Fig．4 Effect of soybean powder on the mycelium dry weight

进一步以氯化钾作浓度梯度试验结果如图6所示。由图6可知，当培养基中氯化钾添加量为1～2 g/L时，桑黄菌丝体干质量呈上升趋势;当添加量大于2 g/L时，其干质量开始下降;故添加量为2 g/L时，获得菌丝体干质量最大，为0．29 g/L。因此，确定氯化钾的添加量应为2 g/L。

2．2 多因素的L9(34)正交试验结果

多因素的L9(34)正交试验结果见表1。

根据表1的试验结果进行极差分析表明:试验与理论较优组合均为A2B1C2即玉米粉30 g/L，黄豆粉 10 g/L，氯化钾 2 g/L，KH2PO44 g/L、MgSO42 g/L、VB10．1 g/L，该组合恰好为第4试验号的组合，使桑黄菌在摇瓶发酵培养条件下其菌丝体干质量可达2．23 g/100mL。

图5 无机盐对菌丝干质量的影响Fig．5 Effect of inorganic salt on the mycelium dry weight

3 讨论

本试验仅对桑黄摇瓶发酵培养基配方中碳源、氮源和无机盐种类及浓度进行优化筛选，初步获得了较优发酵培养配方，即玉米粉30 g/L，黄豆粉10 g/L，氯化钾2 g/L，KH2PO44 g/L、MgSO42 g/L、VB10．1 g/L，使桑黄菌在摇瓶发酵培养条件下其菌丝体干质量可达2．23 g/100 mL。为进一步探索桑黄的摇瓶发酵工艺条件提供了较有价值的试验数据。采用筛选到较优发酵培养基配方，分别进行不同起始pH值、不同摇瓶装量、不同接种量、不同温度、不同摇瓶转速和不同发酵周期等发酵条件的忧化筛选有待进一步深入研究。