大豆富硒灵芝菌固体发酵产氨基酸工艺的优化研究

杜亚楠，涂晓嵘，胡志斌，李庆蒙，魏赛金，2*

(1．江西农业大学 生物科学与工程学院/南昌市发酵应用重点实验室，江西 南昌 330045;2．江西农业大学 作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西 南昌 330045)

灵芝(Ganoderma lucidum)是名贵药用真菌，自古被誉为延年益寿之佳品，功可补气益血，养血安神、临床应用非常广泛［1］。硒是人体必需的微量营养元素之一，缺硒会直接导致人体免疫能力下降。临床医学证明，威胁人类健康和生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关［2－5］。

本文以大豆为原材料接种富硒灵芝液体种子，探索大豆固体发酵产氨基酸新工艺，为开发大豆既富含游离氨基酸，又含灵芝多糖及微量有机硒的高营养价值食品提供了新思路。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种 灵芝730(江西农业大学生物科学与工程学院实训基地提供)。

1．1．2 主要试剂与仪器 抗坏血酸、氨基酸标准液、茚三酮试剂、亚硒酸钠，以上均为分析纯。722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)等。

1．1．3 供试培养基 斜面培养基:PDA培养基［6］;一级液体种子培养基:去皮土豆300 g，蔗糖20 g，酵母膏 2．0 g，大豆蛋白胨 5．0 g，KH2PO41．0 g，MgSO4·7H2O 2．0 g，pH 5．5，蒸馏水 1 000 mL;二级液体种培养基:蔗糖80 g，大豆蛋白胨5．0 g，酵母膏5．0 g，KH2PO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl25 g，土豆200 g，pH 5．5，蒸馏水1 000 mL;固体发酵培养基［7］:浸泡过夜的大豆洗净，沥干水分，在250 mL三角瓶中分别盛不同重量的浸泡过夜的大豆，121℃灭菌30 min，备用。

1．2 方法

1．2．1 菌种的活化［8］取实验室冰箱保存的灵芝菌种，接种于PDA斜面，置于30℃恒温培养箱培养7 d，即得活化斜面菌种。

1．2．2 灵芝液体菌种的制备 从活化好的斜面中挖取0．5 cm2左右的菌块1～2块，接入一级液体培养基中，装液量为50 mL/250 mL。30℃ 180 r/min振荡培养3～4 d［9］。将培养好的一级种子液按10%的接种量接种到亚硒酸钠终浓度为300 μg/mL的二级液体培养基中，装液量为50 mL/250 mL，在30℃ 180 r/min培养4 d，即得富硒灵芝种子液。

1．2．3 单因素试验［10］(1)培养温度试验。取40 g/瓶的大豆固体发酵培养基15瓶，分别接种灵芝液体菌种，接种量10%(v/w)，分别置于26，28，30，32，34℃培养箱内培养。每种温度处理重复3瓶。间歇摇匀，使灵芝菌丝体生长均匀。培养7 d后取培养料烘干检测游离氨基酸总量。

(2)接种量试验。取40 g/瓶的大豆固体发酵培养基15瓶，分别接种灵芝液体菌种，接种量(v/w)分别为5%、10%、15%、20%、25%、30℃恒温培养，每种试验处理重复3瓶。间歇摇匀。培养7 d后取培养料烘干检测游离氨基酸总量。

(3)培养时间试验。取40 g/瓶的大豆固体发酵培养基18瓶，分别接种灵芝液体菌种，接种量10%(v/w)，置于30℃恒温培养，每种试验处理重复3瓶。分别培养至3，4，5，6，7，8 d后取培养料烘干检测游离氨基酸总量。

(4)装量试验。分别取装量30 g/瓶、40 g/瓶、50 g/瓶、60 g/瓶、70 g/瓶的大豆固体发酵培养基各3瓶，分别接种灵芝液体菌种，接种量(v/w)分别为10%，置培养箱中30℃培养。间歇摇匀。培养7 d后取培养料烘干检测游离氨基酸总量。

1．2．4 中心组合试验 根据Box－Behnken中心组合设计原理［11］，分别以不同接种量、不同培养温度和不同培养时间三因素三水平的中心组合试验设计，以游离氨基酸含量为响应值，利用响应面试验结果，探素大豆接种灵芝液体种子进行固态发酵后产游离氨基酸的较佳培养工艺条件。

1．2．5 游离氨基酸总量的测定 将发酵产物按标记倒入平皿中，50℃干燥至恒重，称取干燥样品0．25 g于研钵中，加入12．5 mL体积分数为10%醋酸溶液研磨成匀浆，过滤，滤液加蒸馏水定容至250 mL，保存备用［12］。采用茚三酮法［13］，测定样品中游离氨基酸的含量。

1．2．6 有机硒含量测定 依据参考文献［8］的方法测定大豆干粉和灵芝固态发酵物中有机硒的含量。1．2．7 试验数据统计分析 采用SAS统计学软件。

2 结果与分析

2．1 单因素试验结果

大豆固体培养基接种液体灵芝种子液，分别在不同温度、不同接种量、大豆不同装量和不同培养时

图1 单因素试验结果Fig．1 The result of single factor experiment

间进行固体发酵培养对游离氨基酸总量影响的单因素试验结果分别见图1(a)、图1(b)、图1(c)和图1(d)。

由图1(a)可知:在温度30℃时，大豆固体培养基接种液体灵芝种子液进行固体发酵7 d后，发酵大豆中的游离氨基酸的产量高达223．0 mg/100 g。

由图1(b)可知:大豆固体培养基接种10%液体灵芝种子液进行固体发酵为较适宜的接种量，固体发酵7 d后，发酵大豆中的游离氨基酸的产量高达238．2 mg/100 g。

由图1(c)可知:大豆固体培养基接种10%液体灵芝种子液进行固体发酵6 d后，发酵大豆中的游离氨基酸的产量高达254．4 mg/100g。

由图1(d)可知:大豆培养基在250 mL三角瓶中的不同装量，接种10%液体灵芝种子液进行固体发酵7 d后，发酵大豆中的游离氨基酸的产量差异不显著。

在各个水平灵芝菌丝体的生长变化不大，游离氨基酸的含量比较接近，差异不明显。由此可知在接种量一定的情况下，装瓶量对灵芝固态发酵的影响不显著。

2．2 采用响应面分析法对灵芝大豆固态发酵条件的优化结果

2．2．1 响应面分析因素的选取 根据Box－Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取接种量、培养时间、培养温度对游离氨基酸含量影响显著的3个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Tab．1 Factors and levels of experiment of Response Surface Analysis

2．2．2 响应面分析试验设计方案 以接种量X1、培养时间X2、培养温度X3为自变量，以游离氨基酸的含量为响应值(Y1)，进行响应面分析试验。试验方案及试验结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果Tab．2 Observed and estimated values for different levels of experimental design

2．2．3 多元二次响应面回归模型的建立与分析 对表2试验结果通过SAS软件程序进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型:Y1=276．372 3+6．238 95X1+9．233 85X2－ 8．498 3X3－11．052 62X1X1－4．484 7X1X2+5．003 4X1X3－ 7．008 417X2X2－ 5X2X3－ 34．479 52X3X3，各因素的方差分析见表3。

表3 二次响应面回归模型方差分析Tab．3 Analyze of mean square

从表3可以看出，回归模型是显著的(P＜0．000 1)，该模型的决定系数为X2(培养时间)、X3培养温度)、X1(接种量)、X1X3(接种量与培养温度的交互作用)、X2X3(培养时间与培养温度的交互作用)，X1X2(接种量与培养时间的交互作用)它们的Prob＞ F 值分别为0．000 366，0．000 541，0．002 219，0．022 327，0．022 388，0．032 774 对游离氨基酸总量的影响显著，说明该模型的拟合度较好。从表3中还可以看出，影响游离氨基酸含量的各因素按影响大小排序依次为 X2(培养时间)、X3(培养温度)、X1(接种量)。

由图2 可得出，X1、X2、X3存在极值点，Y1的最大估计值为 280．56 mg/100 g，对应的因素为接种量10．53%，培养温度29．34 ℃，培养时间为6．68 d。

图2 接种量、培养时间、培养温度对氨基酸含量影响的响应面图Fig．2 Surface layer of the effects of inoculation amount，culture time，culture temperature on amino acid content

2．2．4 验证试验 采用优化所得5个试验组合进行灵芝对大豆固体发酵试验，所得游离氨基酸的含量分别:279．36 mg/100 g、278．96 mg/100 g、280．01 mg/100 g、278．98 mg/100 g、278．44 mg/100 g，平均含量为279．15 mg/100 g。初步探素到利用响应面法对富硒灵芝对大豆固态发酵培养优化条件:大豆固体培养基接种灵芝富集液体种子液，接种量10．53%、发酵温度29．34℃，发酵时间6．68 d后，发酵大豆中的游离氨基酸可达280．56 mg/100 g，与优化前的游离氨基酸含量 169．55 mg/100 g［7］，相比提高了64．64%。

2．3 有机硒含量测定结果

由图3结果表明，灵芝固态发酵物的有机硒含量为0．036%，而大豆粉中的有机硒含量为0．017%，优化后有机硒的含量提高了1．1倍。

图3 灵芝固态发酵菌丝体与大豆的常规有机硒的含量的比较Fig．3 Comparison of solid fermentation of Ganoderma mycelium and soybean conventional organic selenium content

3 小结与讨论

大豆固体培养基接种富硒灵芝种子液，分别在不同温度、不同接种量和不同培养时间进行固体发酵培养的单因素试验中，分别获得较佳培养温度为30℃、接种量10%、大豆发酵培养6 d后，大豆发酵物中的游离氨基酸含量可达220 mg/100g以上。在单因素试验结果的基础上，采用响应面中心组合设计试验，进一步探索到利用响应面法对富硒灵芝大豆固态发酵培养较优组合条件:大豆固体培养基接种灵芝富集液体种子液，接种量10．53%、发酵温度29．34℃，发酵时间6．68 d后，发酵大豆中的游离氨基酸可达280．56 mg/100 g，与优化前的游离氨基酸含量169．55 mg/100 g相比提高了64．64%;发酵大豆中有机硒的含量可达0．036%，与优化前相比提高了1．1倍。

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