HMGB1半胱氨酸残基氧化还原状态与其功能①

陈 岩 综述 秦阳华 沈 茜 审校 (第二军医大学附属长海医院实验诊断科，上海200433)

高迁移率族蛋白1(High Mobility Group box 1，HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白，在许多疾病中发挥重要作用。现有越来越多的研究表明HMGB1蛋白第106位点上半胱氨酸残基的氧化还原状态与其功能特性密切相关。

1 HMGB1的结构与功能

高迁移率蛋白(High Mobility Group，HMG)是一组非组蛋白核蛋白，广泛表达于真核生物细胞中，早于20世纪60年代由细胞核中提纯获得，经过几十年的发展又分为几大家族，高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)是HMG超家族中的一员。

HMGB1是一种在大多数真核细胞中表达丰富(106分子/细胞)、高度保守的非组蛋白核蛋白，由215个氨基酸组成。哺乳动物的HMGB1有98.5%氨基酸序列具有同源性，在细胞内外发挥着不同功能。近来许多实验表明其23、45和106位点上的半胱氨酸残基，尤其是106位点上的半胱氨酸残基的氧化还原状态对HMGB1的功能有重要影响。HMGB1包含两个带正电的DNA结合域:A盒与B盒和一个带负电的酸性羧基端(图1)［1］。

HMGB1是由215个氨基酸残基组成的25 kD的蛋白质，其中超过20%为赖氨酸，由3个独特的结构域组成，分别为两个负电的DNA结合域(A盒，B盒)，一个带正电的羧基端(由30个谷氨酸和天门冬氨酸组成)，其中A-box位于N末端，进化高度保守;C-tail在羧基末端，包含30个重复的天冬氨酸和谷氨酸残基，可参与调节HMGB1与DNA结合的亲和力，B-box位于两者之间。A-box和B-box均由3个螺旋组成，并带有强烈的正电荷，构成HMGB1的非特异性DNA结合域。HMGB1释放至胞外后主要由B-box发挥促炎功能，A-box对B-box有拮抗作用，而B-box中的106位点在HMGB1发挥促炎作用时起了重要作用，当106位点被氧化HMGB1就丧失了促炎活性。

HMGB1是一种具有双功能的警报蛋白，可以启动天然免疫和获得性免疫应答，参与多种疾病过程。然而，其功能尚未完全明确;研究者发现在细胞核内和在细胞外HMGB1发挥着不同的生物学效应。在细胞核内，HMGB1的DNA结合域与DNA的双螺旋小沟结合引起了DNA的构象变化，并参与DNA的转录、修复、复制及核小体的稳定;一旦释放到细胞外，就会作为细胞因子激活炎症细胞产生促炎细胞因子如 TNF-α、IL-1 和 IL-8 等［2］;从胞核转移到胞浆的HMGB1参与了细胞自噬的调节［3］。较早的研究者认为HMGB1的促炎活性是通过与高度糖基化终末产物受体(receptor for advance glycation end products，RAGE)结合实现的，因RAGE基因缺陷的小鼠其巨噬细胞被HMGB1刺激产生促炎细胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)的能力大大下降。RAGE是第一个被发现的HMGB1的受体，表达在单核-巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞［4］。通过RAGE刺激下游的Cdc42与Rac，HMGB1可以介导趋化作用、参与细胞生长、免疫细胞的分化、平滑肌细胞及免疫细胞的迁移［5-8］。肿瘤细胞内的 HMGB1也是通过与RAGE的结合激活细胞内的p38MAPK和Racl，并通过激活细胞外ERK、JNK、AKT等信号促进肿瘤细胞的增殖、浸润、转移和诱导肿瘤的血管形成的［9］。随着研究的进一步深入，人们发现HMGB1的促炎活性主要是与 Toll样受体(TLR)4有关。Yang等［10］用TLR2、TLR4基因缺陷小鼠和正常小鼠的腹膜巨噬细胞经HMGB1刺激后，发现TLR4缺陷的巨噬细胞不能产生TNF-α，IL-1β和IL-6的产生也大大下降，说明TLR4在HMGB1促免疫细胞释放促炎细胞因子中是必需的。除了参与促炎细胞因子的释放外，HMGB1与树突状细胞表达的TLR4结合在肿瘤的放、化疗后抗肿瘤免疫反应中起积极作用，TLR4基因突变的乳腺癌病人放疗、化疗后肿瘤复发的速度较 TLR4基因功能正常的病人快［11］。当HMGB1与寡核苷酸结合形成复合物后就能与另外一个受体TLR9交互作用，在肝脏缺血再灌注损伤中产生病理损伤效应［12］。有研究表明HMGB1与一些促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6)和细菌产物LPS共孵育后产生协同效应，诱导生成的促炎细胞因子浓度是 HMGB1单独刺激产生的 10倍［13］。Qin等［14］发现用HMGB1增强了LPS刺激小鼠腹膜巨噬细胞产生促炎细胞因子的能力，但这种结合是有选择性的，原因尚未阐明。在一些炎症疾病中HMGB1的释放促进促炎细胞释放更多的促炎细胞因子，这些促炎细胞因子又会进一步促进HMGB1的释放，产生正反馈循环加剧了疾病的发生和发展。

2 HMGB1的氧化还原状态对其功能的影响

HMGB1的三级结构显示23和45位的半胱氨酸残基在空间上是反向的，且暴露在分子表面易于受氧化剂的影响形成交联的二硫键，而106位点隐藏于HMGB1 L型沟槽内，不参与HMGB1氧化还原依赖的构象变化。蛋白质二级结构的改变会影响蛋白质的功能，外环境氧化还原状态的改变会影响HMGB1的空间构象从而影响了HMGB1的功能。

还原状态时的HMGB1三个位点上的残基均为还原状态，在氧化条件下23和45位的半胱氨酸残基交联形成二硫键，106位点亦被氧化，此时的HMGB1丧失了免疫活性。然而，在轻微的氧化环境中虽然23和45位点上的半胱氨酸残基被氧化，106位点上的半胱氨酸却仍处于还原状态时可以刺激炎症的发生。Hoppe等［15］利用定点突变技术将HMGB1氨基酸序列的23、45和106位点单独或联合突变为丝氨酸，破坏了二硫键的形成。突变体转染细胞后发现23、45单独或联合突变或三个位点均突变产生的HMGB1均为还原状态，且单独或联合将23、45位点突变后并不影响HMGB1在细胞核内的分布，而106位点半胱氨酸残基突变的HMGB1主要表达在胞浆。在此基础上 Tang等［3］发现HMGB1 106位点半胱氨酸突变成亮氨酸后自噬标记物LC3的量也增加了，由此可见106位点不仅对于HMGB1在胞浆到胞核之间的穿梭起重要作用，更参与了自噬的调节。106位点半胱氨酸残基氧化还原状态的改变不仅仅影响了HMGB1在细胞内的分布，106位上半胱氨酸替换成赖氨酸的重组HMGB1蛋白不能与TLR4/MD2结合，不能介导刺激巨噬细胞产生TNF-α。为了进一步确认此位点在这一过程中的重要性，人工合成了包含B盒前20个氨基酸的肽段(89～108位点，TLR4结合位点)，其106位点上的半胱氨酸替换成丝氨酸后，这一肽段也不能刺激巨噬细胞产生TNF-α［10］。先前的研究者认为凋亡细胞产生HMGB1的量较少、且与DNA结合较紧密，故不能激活免疫系统。Urbonaviciute等［16］在最近的研究中发现，在细胞死亡过程中HMGB1半胱氨酸残基经历了可逆的氧化修饰，从而丧失了免疫活性。将3种不同位置突变的重组HMGB1加入与凋亡细胞共孵育的树突状细胞、再加入氧化剂H2O2后发现:106位点突变后的HMGB1能够阻止由凋亡细胞诱导的免疫耐受的产生，维持了免疫原性［17］。总之，HMGB1通过 TLR4诱导细胞因子产生的过程中，106位点上的半胱氨酸扮演了重要角色。

图1 HMGB1的结构Fig.1 Structure of human HMGB1

3 HMGB1的氧化还原状态与自噬

自噬是一个动态复杂的过程，在细胞受到损伤时从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬所起的作用是正面还是负面的，尚未完全阐明。Tang等［18］对HMGB1进行研究时发现HMGB1的释放在细胞的凋亡与自噬的发生中起到了交叉调节的作用，决定了细胞死亡或生存。这个概念延伸到抗肿瘤治疗时HMGB1既可以参与肿瘤细胞的增殖、浸润、迁移，促进肿瘤的发生发展;又可以通过TLR诱导T淋巴细胞的活化，发挥抗肿瘤的作用。在肿瘤的放射治疗过程中，肿瘤细胞释放的大量活性氧(ROS)氧化了HMGB1的半胱氨酸残基，使HMGB1丧失了免疫活性，诱导机体对肿瘤抗原免疫耐受的形成。放射治疗和一些细胞毒药物在刺激肿瘤细胞凋亡的同时也使细胞产生了自噬，Liu等［19］发现在白血病细胞系HL-60细胞中加入外源性HMGB1后自噬增加了，也降低了肿瘤细胞对药物的敏感性，这种类似于“弃车保帅”的行为使肿瘤细胞逃避药物的作用。同时HMGB1大量释放又促进自噬的发生，该作用充当了促细胞存活信号的角色，降低了抗肿瘤治疗的效果。对于自噬通路的研究，Kang等［20］发现胞浆内的HMGB1与Bcl-2竞争性结合Bcline-1，在调节自噬溶酶体形成过程中起到了重要作用。然而释放到细胞外的HMGB1在调节自噬的产生时受自身氧化还原状态的影响，其中106位点状态不同的HMGB1在抗肿瘤治疗过程中所起作用亦不同。Tang等［18］使用两种不同状态的 HMGB1(23和45位点半胱氨酸残基交联成二硫键，只在106位点氧化还原状态不同)进行研究发现:在人结肠癌细胞和胰腺癌细胞中使用还原型 HMGB1，可通过与RAGE结合促发了Bcline-1依赖的自噬，促进了肿瘤细胞对细胞毒药物的抵抗;而氧化型HMGB1则增加了这些药物的细胞毒性及与此引发的caspase-9/-3通路介导的凋亡。这些现象让我们思考能否有种方法使 HMGB1能够保持免疫活性，Kazama等［17］利用定点突变技术将易被氧化的第23、45、106位点半胱氨酸突变为丝氨酸，此突变体不会被细胞间氧氧化，既保留了免疫原性又可激活树突状细胞引起T淋巴细胞介导的免疫应答。我们认为可以将HMGB1的这一特性、结合传统的治疗方法，可能为肿瘤的治疗找到一个新靶点。

4 展望

虽然抗HMGB1治疗在许多疾病中都取得了不错的效果，但是HMGB1释放抑制剂不能产生特异性效果，而抗HMGB1抗体在应用于人体时需人源化，否则会产生人抗异源性抗体反应。同时，在肿瘤治疗过程中HMGB1的不同状态也会产生不同的效果。鉴于此，我们认为可以通过制备HMGB1的突变体，在炎症反应时此突变体会与受体结合，通过竞争性抑制内源性HMGB1与受体的结合、而不产生炎症效应，又不影响其他分子的作用。在肿瘤治疗过程中，制备的突变体可以避免HMGB1重要位点的氧化，保持其免疫活性，提高治疗效果和特异性。

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