自体DC-CIK细胞联合培美曲塞治疗老年非小细胞肺癌的疗效与安全性①

彭大为 李建旺 元建华 刘英平 于伟玲 孟 娟 罗 洁

(海口市人民医院(中南大学湘雅医学院附属海口医院)肿瘤科，海口570208)

非小细胞肺癌(NSCLC)在肺癌患者中占80%～85%，30%患者可行手术治疗［1］。约70% ～80%的患者发现时已属中晚期。美国报道，肺癌确诊时，50%已超过65岁，30%超过70岁。意大利报道65岁以上的肺癌病人占60%以上。我国肺癌发病年龄自40岁开始上升，发病及死亡高峰均在75岁左右。70岁以上的老年患者构成一组特殊的庞大的NSCLC人群，其治疗对策成为临床研究的重要内容。体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是继手术、化疗、放疗之外的另一种重要的肿瘤治疗方法。树突细胞(DC)识别病原，激活获得性免疫系统，杀伤细胞(CIK细胞)通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫反应的完成。2008年9月26日美国食品药品监督局批准培美曲塞(Pemetrexed disodium，PEM)联合顺铂作为NSCLC的一线药物，适用于ⅢB/Ⅳ期非鳞癌。我们通过采用DC/CIK联合培美曲塞二钠或培美曲塞二钠单药治疗47例老年中晚期NSCLC，观察其疗效和不良反应。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院肿瘤科自2009年1月至2011年6月经病理组织学或细胞学检查确诊，且均经X线、CT等检查有明确病灶的ⅢA～Ⅳ期初诊肺腺癌患者47例，KPS评分70～90分。其中男性29例，女性18例;年龄65～79岁，中位年龄71岁，75岁以上4例;临床分期:ⅢA期8例，ⅢB期24例，Ⅳ期15例。47例患者随机分为联合治疗组:DC/CIK联合培美曲塞二钠(n=24)和单纯化疗组:培美曲塞二钠(n=23)单药治疗。所有病例在接受药物治疗前，均未接受化疗及放疗，两组年龄、病理类型、临床分期等无显著性差异。

1.2 治疗方法

1.2.1 DC、CIK细胞的培养和扩增 患者入院后行X线、CT检查。根据X线、CT确定肿瘤大小，计算出肿瘤体积。采血前24小时应用GM-CSF行外周血干细胞动员，经CS-3000血细胞分离机分别采集患者的外周血5L中的新鲜抗凝外周血单核细胞(PBMNC)，再用聚蔗糖400(中国科学院生物物理研究所)分离后经Hank's液洗3次，收集纯度在90%以上的外周血单个核细胞，调整浓度为1×106L-1。第一天加rh-干扰素γ1 000 U/ml，第2天开始加入抗CD3单抗 50μg/ml，IL-1a 100 U/ml，IL-2 1 000 U/ml，连续培养3天，更换含有上述因子的培养液1次，连续培养10～20天，每周2次测定白细胞增殖率和 CD3、CD56阳性细胞率，然后以DC∶CIK=1∶3比例和CIK细胞混合，用CIK培养液培养产生DC-CIK细胞。用台盼蓝拒染法计数，动态观察DC共培养物的表型变化，分别于细胞培养的第9天检测DC表面标记CD40、CD80、HLA-DR和第9、14天检测CIK和DC-CIK共培养物表面标记CD3、CD56、CD4、CD8。当细胞数扩增阳性目标值达到85%及以上时进行细胞治疗。

1.2.2 培美曲塞二钠组治疗方法 培美曲塞二钠(江苏豪森有限公司生产，商品名普来乐)500 mg/m2，静脉滴入超过10分钟，1天，21天为1个周期;培美曲塞二钠使用前1周开始每日口服叶酸400μg，直到培美曲塞二钠治疗结束后3周;培美曲塞二钠使用前1周开始，每3个化疗周期肌肉注射一次维生素B12 1 000μg;培美曲塞使用前24小时口服地塞米松4 mg，2次/天，连服3天。

1.2.3 DC/CIK联合培美曲塞二钠治疗方法 患者行PBMNC采集后，行培美曲塞二钠治疗。采集后经实验室培养2周左右，进行回输DC细胞及CIK细胞，2～3次/周，一次回输 DC细胞1×109～1×1010，CIK 1×1010～2×1012。每隔1个月重复治疗1周期。

两组化疗前均常规给予5-HT3受体拮抗剂等预防呕吐，化疗期间监测血常规，出现Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制时给予粒细胞集落刺激因子，化疗过程配合支持治疗。入选患者至少接受2个周期以上化疗，最多接受6个周期化疗。

1.3 疗效评价 疗效评价采用螺旋CT增强扫描，每2个周期进行评价，依据实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行疗效评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)，临床获益率CR+PR+SD。不良反应依据美国国立癌症研究所常见毒性标准(CTC310)进行评价。生存质量评价根据患者Karnofsky评分和体质量;中位生存时间(MST)定义为半数患者经历死亡或末次随诊时间。生存期为治疗开始至死亡或末次随诊的时间。随访截止时间是2011年12月。

1.4 统计学处理 应用SPSS15.0软件进行统计学分析。两组间疗效、1年生存率及不良反应发生率比较用χ2检验;两组间中位生存时间比较用 Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK和DC-CIK培养结果 CIK和DC-CIK共培养的增殖活性细胞因子诱导的CIK细胞均明显增殖，而DC-CIK共培养细胞具有更高的增殖活性。细胞在第3天后开始增殖，第5～6天快速增长，培养20天时，CIK细胞和 DC-CIK共培养的细胞增殖倍数分别为120和1 000。CIK对Bel-7404细胞的细胞毒活性为46.8%。

2.2 免疫治疗前后患者外周血免疫学指标变化联合治疗组患者治疗后外周血CD3+CD8+双阳性细胞的比例升高(P＜0.05)，CD3+CD56+双阳性细胞的比例大幅升高(P＜0.01);单纯组患者治疗后外周血CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比例无明显变化(P＞0.05)。两组间比较差异有显著统计学意义(P ＜0.01，表1)。

2.3 疗效观察 患者经1个疗程 DC-CIK静脉回输治疗后自觉症状改善，食欲增强，睡眠改善，疼痛减轻，体质量无明显下降，体力较前好转，培美曲塞治疗的毒副反应减轻。联合治疗组和单纯化疗组临床获益率分别是 66.67%和 56.52%(P ＜0.05，见表 2)，中位生存期分别是 9.3 个月和8.7 个月(P ＞0.05)，1 年生存率分别是27.6%和 25.4%(P ＞0.05)。

2.4 两组患者治疗的不良反应 依据美国国立癌症研究所制定的通用药物毒性反应标准，化疗期间两组患者均出现Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制及消化道反应。在联合治疗组患者接受免疫治疗过程中，并未出现Ⅲ度以上严重不良反应。回输后常见的不良反应(7例)为发热，多数可自行消退，1例采用解热镇痛药。1例出现过性寒战，肌注异丙嗪后缓解。两组主要的不良反应是骨髓抑制和胃肠道反应以及乏力，其中联合治疗组中性粒细胞降低发生率明显低于单纯化疗组(Ⅰ ～Ⅱ度:9.05%vs 19.09%，P＜0.05)，Ⅲ ～ Ⅳ度:2.52%vs 9.27%，P ＜0.05);联合治疗组胃肠道反应发生率也明显低于单纯化疗组(Ⅰ ～ Ⅱ度:6.29%vs 15.09%，P ＜0.05;Ⅲ ～ Ⅳ度:2.76%vs 8.91%，P ＜0.05)。

2.5 治疗前后患者的临床受益反应变化 联合治疗组患者治疗前KPS评分80分者5例，70分者12例，60分者7例;治疗后显效9例，有效9例，总有效率75%。单纯化疗组患者治疗前KPS评分80分者6例，70分者10例，60分者7例;治疗后显效4例，有效7例，总有效率52.2%。联合治疗组治疗有效率高于单纯化疗组(P＜0.05)。联合治疗组治疗前 KPS 评分70.2 ±5.8，治疗后 79.1 ±9.3，较治疗前升高(P＜0.05)，单纯化疗组治疗前KPS评分71.5 ±7.5，治疗后72.8 ±10.5，较治疗前无明显变化(P＞0.05)。两组间比较差异有显著统计学意义(P ＜0.01，表3)。

表1 两组患者治疗前后血清肿瘤标志物变化的比较Tab.1 Comparison of the serum tumor markers before and after the therapy in 2 groups

表2 联合治疗组和单纯化疗组疗效对比Tab.2 Comparison of therapeutic effect between combination therapy group and chemotherapy group

表3 两组患者治疗前后的临床受益反应比较Tab.3 Comparison of the clinical benefit response before and after the therapy in 2 groups

3 讨论

晚期非小细胞肺癌常用含铂类的联合化疗，有效率在30% ～50%［2］。并且，年龄的增加意味着患者骨髓储备功能降低，药物的清除能力降低，老年患者的整体化疗耐受性差，因此选择安全高效的化疗方案一直是肿瘤科医师的研究方向。目前，铂类药物联合第三代化疗药物已成为晚期NSCLC患者的标准一线治疗方案，但是在总有效率、1年生存时间等方面仍然不尽如人意，而且其不良反应如血小板减少、贫血较多，影响了患者的依从性［3］。培美曲塞(Pemetrexed)是一种多靶点叶酸拮抗剂，其作用机制主要是通过抑制胸苷酸合成酶(Thymidylate synthetase，TS)二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)和甘氨酸核糖核苷甲酰基转移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase，GARFT)从而阻断嘌呤和嘧啶合成使细胞分裂停止于S期抑制肿瘤细胞的生长［4］，2004年美国 FDA批准培美曲塞用于晚期NSCLC的二线治疗。2008年9月26日美国食品药品监督局批准培美曲塞联合顺铂作为NSCLC的一线药物，适用于ⅢB/Ⅳ期非鳞癌。

Bearz等［5］于2008年报道了一项Ⅲ期临床研究，培美曲塞二钠二线治疗160例老年肺癌患者，有效率40%，中位生存期12个月，较先前报道更有效，同时中性粒细胞下降、发热等不良反应也显著降低。2009年的ASCO会议上，礼来公司公布了力比泰(注射用培美曲塞二钠)在663例受试者应用的临床试验结果，该试验证实力比泰作为维持疗法药物时，可以延长患者的总体生存期，在非鳞癌受试者当中，力比泰受试组平均生存期可长达15.5个月，而安慰剂对照组仅为10.3个月。试验证实，老年肺癌患者如果PS评分较好，化疗较维持治疗能显著延长生存期和改善生活质量［6］。Grnberg［7］报道培美曲塞治疗效果好，且毒副反应轻而被与铂类药物联合应用于晚期NSCLC的一线治疗。另外，培美曲塞对于晚期NSCLC的疗效与NSCLC的病理类型相关，培美曲塞可显著性提高腺癌及大细胞肺癌的生存率，可能与腺癌患者胸苷酸合成酶(TS)的表达水平显著低于鳞癌患者，使得叶酸代谢被培美曲塞更好地抑制有关［8］。

DC是目前为止发现的人体最有效的抗原提呈细胞(APC)之一。APC与T细胞之间的相互作用所诱发的免疫应答是免疫抑瘤效应的中心环节。DC在大多数组织体内以未成熟状态存在，不能直接刺激T细胞，但具有特殊的捕获和加工抗原的能力。肿瘤细胞表面缺乏MHC和共刺激分子，无法激活T细胞免疫，是肿瘤免疫逃逸的重要机制［9］。DC与CIK共培养后产生的细胞群体比同原CIK细胞具有更强的增殖活性。CIK与DC相结合，不仅提高了CIK细胞的细胞毒作用，也能显著提高DC的功能［10］，DC与CIK混合培养时，两者能相互调节而增加细胞因子释放和增强细胞毒性，显著提高CIK细胞的增殖能力和杀伤活性，临床治疗效果优于CIK等其他效应细胞。体内外实验研究均表明DC能诱导肿瘤宿主对特异性抗原的免疫应答，提高肿瘤宿主免疫效应细胞的抗病毒活性［11］。CIK同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞能分泌多种细胞因子(如IL-4、IFN-α 等)，且具有比 LAK、CD3AK 细胞更强的杀伤活性［12］。国内外的临床研究表明，一般在放疗、化疗后间隔2～4周，在机体免疫力有所恢复时，输入CIK细胞，可提高肿瘤患者的缓解率，并在清除微小残留病灶方面发挥重要作用［13］。

本研究中，47例患者均完成2个周期以上化疗且可评价疗效，两组患者疗效均较好，但联合治疗组具有更好的临床获益及更少的不良反应，并且具有更高的生存质量。研究结果表明，自体CIK细胞及DC细胞联合培美曲塞治疗老年中晚期NSCLC疗效较好，不良反应轻，可作为老年中晚期NSCLC一线治疗的选择之一。但由于本研究病例数较少，尚需扩大病例进一步证实。

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