SU11248诱导K562白血病细胞凋亡的分子机制研究①

林东红 崔兆磊 孔令英 林振兴 胡建达 (福建医科大学检验医学系，福州350004)

舒尼替尼(SU11248)，全称苹果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)，商品名索坦(Sutent)，是美国辉瑞(Pfizer)公司推出的一种新型多靶点血管生成抑制剂。2006年1月获得FDA批准上市。该药作为分子靶向药物用于恶性肿瘤的治疗，已成为当前研究的热点。其通过靶向性抑制多种酪氨酸激酶和生长因子受体，阻断多种信号通路，而起到抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖的作用。临床研究表明，该药具有广谱的抗肿瘤活性，尤其对肾细胞癌、胃肠道间质瘤、乳腺癌等实体性肿瘤具有良好的抑制效果。本实验拟研究SU11248对慢性骨髓性白血病K562细胞的作用，探究相关分子机制，为该药作为抗肿瘤新药应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清FBS购自Hyclone公司。SU11248购自Biocompound公司，溶解于二甲亚砜(Dimethylsulfoxide)，-20℃避光保存。CCK-8试剂盒为日本同仁产品。细胞周期试剂盒购自南京凯基。兔抗人Bcl-2、Bax单抗及鼠抗人p73单抗购自Abcam公司，兔抗人Caspase-3、Caspase-9多抗及鼠抗人p53单抗购自Santa Cruz公司。DAPI染液、免疫荧光染色试剂盒、兔抗人NF-κB p65单抗、鼠抗人Cyto C、β-actin单抗购自江苏碧云天。

1.1.2 细胞株 人慢性骨髓性白血病K562细胞株购自中科院上海细胞库，由福建省血液研究所传代保存。用含10%FBS的 RPMI1640培养基，置37℃，5%CO2温箱及饱和湿度条件下培养，2～3天换液传代1次。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK-8比色法检测SU11248对 K562细胞增殖的影响 取对数期细胞按5×103个细胞/孔接种至96孔培养板，体积100μl。实验设药物组(SU组)、二甲亚砜组(排除药物溶剂毒性)及空白对照组，每组5个复孔。SU组分别与终浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 μg/ml 的 SU11248 共培养［1］。于培养 24、48、72、96 小时后，每孔加入10 μl CCK-8，继续培养3小时。酶标仪测每孔450 nm和630 nm双波长下吸光度OD值。实验重复3次，以OD值为纵轴，药物作用时间为横轴绘制细胞生长曲线。取48小时OD值计算各组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1-药物组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.2 细胞周期分析 分别收集各组细胞，PBS洗涤2次，用70%乙醇 4℃固定过夜。加100μl RNase A 37℃水浴30分钟，再加400μl PI染色混匀，4℃避光30分钟，FCM检测。结果用MultiCycle AV DNA Analysis软件分析。

1.2.3 间接免疫荧光染色 收集各组细胞，加固定液固定30分钟，洗涤后转至载玻片，稍晾干，加封闭液封闭1小时。分别加入鼠抗人 p53单抗(1∶300)、p73 单抗(1∶250)、Cyto C 单抗(1∶50)及兔抗人NF-κB单抗(1∶300)，4℃孵育过夜。洗涤后加入羊抗鼠Cy3二抗和羊抗兔FITC二抗(均为1∶1 000)，避光孵育1小时。加DAPI染色液避光染色3～5分钟，PBS洗涤后加盖玻片，荧光显微镜下观察。实验设两组阴性对照:一组不加一抗和荧光标记二抗，用于荧光强度的基线校正;一组仅加荧光二抗，用于非特异性结合对照。

1.2.4 免疫印迹实验 提取各组细胞总蛋白，取50μg行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2小时，分别加入兔抗人单克隆一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶300)，兔抗人多克隆一抗 Caspase-9(1∶200)、Caspase-3(1∶150)，鼠抗人单克隆一抗 p53(1∶300)、p73(1∶500)、Cyto C(1∶300)及 β-actin(1∶1 000)，4℃孵育过夜。洗膜，分别加 HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000)，继续孵育2小时，加ECL发光液，X射线曝光显影。β-actin为内参照，数据用SensiAnsys软件分析。

2 结果

2.1 CCK-8法观察SU11248对K562细胞生长的影响 由表1可见，当药物浓度超过1.0μg/ml时，SU组细胞生长较空白对照组和二甲亚砜组明显受抑制(P ＜0.05)。浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0μg/ml的 SU11248作用48小时后，细胞增殖抑制率分别为 3.38%、10.78%、27.09%、61.14%、83.37%、85.67%。随药物浓度的增大和作用时间延长，细胞增殖抑制率也随之增大，当SU11248浓度超过4.0μg/ml时，增殖抑制率随药物浓度增大及时间延长变化不再明显(P＞0.05)。该药对K562细胞半数抑制浓度IC50约为2.5μg/ml。

2.2 FCM分析SU11248对K562细胞周期的影响 由图1可见，浓度分别为 2.5、4.0、8.0 μg/ml的SU11248作用48小时后，G0/G1期的细胞分别占48.3%、79.48%、93.31%，较对照组(40.01%)差异具有统计学差异(P＜0.05)，且S期细胞所占比例(36.54%、20.52%、3.74%)随药物浓度的升高而逐渐减少，较对照组(45.86%)差异具有统计学差异(P＜0.05)。可见，SU11248组较对照组出现G0/G1期细胞阻滞。

2.3 间接免疫荧光染色观察凋亡相关蛋白的表达定位 图2间接免疫荧光染色显示，2.5μg/ml SU11248作用48小时后，SU11248组细胞出现萎缩，胞核碎裂增多，Cyto C在胞质中呈弥散或组块状分布，而对照组Cyto C呈细颗粒状局限分布(图2箭头所示)。SU11248组和对照组 p53和p73表达主要位于胞质，均匀弥散分布，表达差异不明显。两组NF-κB p65均主要定位于胞质呈未激活状态，均匀散在分布，表达差异亦不明显。

2.4 免疫印迹检测SU11248对凋亡相关蛋白表达的影响 免疫印迹结果显示，SU11248组较对照组Bcl-2表达随时间延长呈下降趋势，Bax和Cyto C表达呈递增趋势，同时有Caspase-9和Caspase-3的剪接体增粗激活，而p73、p53及NF-κB p65蛋白的表达随时间变化不明显(图3)，相应灰度值分析见表2。

表1 不同浓度SU11248对K562细胞增殖的影响Tab.1 Effects of SU11248 with different dose on proliferation of K562 cells

图1 不同浓度SU11248对K562细胞周期影响Fig.1 Effects of SU11248 with different dose on cell cycles by Flow cytometry

图2 间接免疫荧光染色显示SU11248作用48小时相关凋亡蛋白的表达定位(叠加图)Fig.2 Effects of SU11248 on the expression and location of apoptosis related proteins by Indirect immunofluorescence(After overlayed)

表2 SU11248组及对照组中凋亡相关蛋白随时间的表达变化Tab.2 The changes of apoptosis related proteins in SU11248 and control group along with time prolonged

图3 SU11248对K562细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.3 Effects of SU11248 on the expression level of apoptosis related proteins in different time points by Western blot

3 讨论

目前，除肾细胞癌和胃肠道间质瘤外，SU11248在乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结肠癌、肝癌、甲状腺癌及鼻咽癌等多种实体性肿瘤治疗中均有报道，而在恶性血液病中的研究并不多见。国外有研究认为该药物可使急性髓性细胞白血病患者达到部分缓解［2］。本实验研究表明，SU11248可明显抑制慢性骨髓性白血病K562细胞的增殖，说明该药对非实体性肿瘤也有较强地抑制作用。

综合文献报道，SU11248主要通过阻断VEGF和PDGF等信号通路(已被证实在促进肿瘤血管生成和细胞增殖中起重要作用)而抑制肿瘤的血管生成及细胞生长。SU11248是一种ATP竞争性蛋白激酶抑制剂，X射线晶体成像显示，该药能结合KIT酪氨酸激酶受体侧链的DFG环［3］。在ATP位点结合区域，该药通过其表面1～3个类似ATP中的氢键，紧密结合KIT酪氨酸激酶受体侧链DFG环的苯丙氨酸残基，占据ATP位点的腺嘌呤核苷区域，同ATP竞争结合受体中的ATP位点(为所有蛋白激酶共有)，阻止 VEGFR-2和 PDGFR-β等结合 ATP，阻断VEGF和PDGF等信号通路，从而进一步抑制Stat3(也可能通过激活IL-6R而抑制 Stat3)，下调Stat3调控血管生成因子基因p-Src、p-STAT3等的表达，最终降低肿瘤微血管密度［4-7］。此外，该药可阻断VEGFR1-3在肿瘤中的自分泌及旁分泌作用，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性，并参与介导抗微血管、淋巴管生成及巨噬细胞诱导的肿瘤血管内渗作用［8，9］。然而 Dan 等［10］发现，采用 siRNA 敲除ccRCC细胞株(高表达 PDGFR-β和 VEGFR-2)的PDGFR和/或 VEGFR基因亚型后并不能影响ccRCC细胞株的增殖，提示SU11248可能并不单独依赖阻断PDGF和VEGF信号途径而抑制ccRCC细胞株的生长。

Fenton等［11］发现该药能抑制肿瘤细胞中RET的自身磷酸化，同时阻断胞质中ERK1/2和JNK的磷酸化，激活信号传感器，使细胞停滞于G0/G1期，从而抑制肿瘤细胞的生长增殖。本研究也发现SU11248可使慢性骨髓性白血病K562细胞停滞于G0/G1期，随药物浓度的升高，G0/G1期细胞所占比例逐渐上升，同时S期细胞比例呈现下降趋势。可见SU11248可以抑制K562细胞有丝分裂的进程，使细胞停滞于G0/G1期而不能进入S期，由于细胞不能进入S期合成核酸等重要生命物质，从而分裂增殖受到抑制。该过程具体机制可能与SU11248参与调节K562细胞周期蛋白表达有关，有待进一步实验证实。

慢性骨髓性白血病中多存在凋亡通路的调节紊乱，其中Bcl-2家族和Caspase家族起着重要作用。已证实细胞内Bcl-2与Bax的比例对细胞凋亡起着重要调控作用。Bcl-2通过线粒体与Procaspase-9等形成复合物，抑制Cyto C的释放等，而起到抗凋亡作用。Bax则通过其基因家族蛋白共有的同源结构域与Bcl-2形成异源二聚体，同时促进Cyto C的释放，从而进一步激活Procaspase-9、Procaspase-3等引起系列级联反应，诱导细胞凋亡。本实验研究发现，SU11248可下调K562细胞中Bcl-2的表达，同时能上调K562细胞中Bax的表达，并可引起凋亡通路的系列级联反应。免疫印迹显示，SU11248组K562细胞胞质Cyto C表达随时间延长表达明显增加，且免疫荧光染色可见SU11248组Cyto C在胞质中呈散在粗块状分布，说明Cyto C已被激活而由线粒体释放入胞质。同时，SU11248组Procaspase-9 37kD剪接体表达增粗，说明Procaspase-9已被激活，同时检测到Procaspase-3 17 kD的剪接体表达增粗，说明Procaspase-3也已激活。早期即有研究报道，p73和p53参与调节细胞的增殖、凋亡过程，且二者之间亦存在相互作用，如p73可转录激活p53上游应答基因等。Gong等［12］认为p73可不依赖p53而被非受体酪氨酸激酶磷酸化激活，而进一步发挥细胞周期抑制及诱导凋亡效应。NF-κB(主要为p65蛋白)也被认为与肿瘤的发生发展密切相关，正常条件下，NF-κB p65主要定位于细胞胞质，呈未激活状态。当其受到炎症、病理损伤等因素刺激时，NF-κB p65就会由胞质转移到细胞核而呈激活状态，从而进一步发挥抑制肿瘤凋亡，促进细胞增殖的作用。本实验发现，SU11248对K562细胞中p73、p53及 NF-κB p65蛋白的表达及定位均没有明显影响，SU11248组和对照组p53和p73表达主要位于胞质，且NF-κB p65均定位于胞质呈未激活状态。以上提示，SU11248可通过激活内源性线粒体细胞途径诱导K562细胞凋亡。

综上所述，本实验发现SU11248可能并不仅仅依赖阻断PDGF和VEGF信号通路而抑制细胞生长。在慢性骨髓性白血病中，SU11248可通过阻滞细胞周期进程及激活内源性线粒体凋亡通路诱导K562细胞凋亡。

1 林东红，罗玲清，陈惠瑜et al.SU11248对骨髓瘤细胞U266增殖及凋亡作用的实验研究［J］.中国免疫学杂志，2009;25(4):312-316.

2 Fiedler W，Serve H，Dohner H et al.A phaseⅠstudy of SU11248 in the treatment of patients with refractory or resistant acute myeloid leukemia(AML)or not amenable to conventional therapy for the disease［J］.Blood，2005;105(3):986-993.

3 Gajiwala K S，Wu JC，Christensen J et al.KIT kinase mutants show unique mechanisms of drugresistance to imatinib and sunitinib in gastrointestinal stromal tumor patients［J］.Pric Natl Acad USA，2009;106:1542-1547.

4 Laderoute K R，Calaoagan J M，Madrid P B et al.SU11248(sunitinib)directly inhibits the activity of mammalian 5'-AMP-activated protein kinase(AMPK)［J］.Cancer Biology ＆ Therapy，2010;10(1):68-76.

5 Gotink K J，Verheul H M W.Anti-angiogenic tyrosine kinase inhibitors:what is their mechanism of action［J］.Angiogenesis，2010;13:1-14.

6 Johnson L N.Protein kinaseinhibitors:contributions from structure to clinical compounds［J］.Q Rev Biophys，2009;42:1-40.

7 Xin H，Zhang CY，Herrmann A et al.Sunitinib Inhibition of Stat3 induces renal cell carcinoma tumor cell apoptosis and reduces immunosuppressive cells［J］.Cancer Res，2009;69(6):2506-2513.

8 Young E，Miele L，Tucker K B et al.SU11248，a selective tyrosine kinases inhibitor suppresses breast tumor angiogenesis and growth via targeting both tumor vasculature and breast cancer cells［J］.Cancer Biology ＆ Therapy，2010;10(7):703-711.

9 Faivre S，Demetri G，Sargent W et al.Molecular basis for sunitinib efficacy and future clinical development［J］.Nature Reviews，2007;6:734-745.

10 Dan H，Yan D，Yan Li et al.Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma［J］.Cancer Res，2010;70(3):1053-1061.

11 Fenton M S，Marion K M，Salem A K et al.Sunitinib inhibits MEK/ERK and SAPK/JNK pathways and increases Sodium/Iodide symporter expression in papillary thyroid cancer［J］.Thtroid，2010;20:965-974.

12 Gong J G，Costanzo A，Yang H Q et al.The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage［J］.Nature，1999;399(6738):806-809.