TGF-β1和ADAM33基因交互作用与儿童哮喘易感性及严重程度相关性①

李宏彬 徐光翠 桂立辉 冯宪军 赵 兵 席景砖 (新乡医学院公共卫生学系，新乡453003)

哮喘是儿童最常见的一种慢性呼吸道炎性疾病，其病因和发病机制涉及到机体免疫、遗传、神经和环境等诸多方面［1］。目前大多数学者认为，在引起哮喘的众多因素中，遗传可能是最为重要的因素。TGF-β1基因是一种具有多功能生物学活性的细胞因子，在调节细胞外基质代谢、参与炎性反应、间质纤维化和抑制免疫监视等方面起重要作用［2，3］。分子生物学研究表明，TGF-β1基因存在多个基因多态性位点参与哮喘的发生，但确切机制尚不明了［4］。ADAM33是首个通过定位克隆发现的哮喘易感性基因［5］，位于人类染色体 20p13，至少包含70个单核苷酸多态性位点，研究表明该基因具有高度多态性，在不同的种族，与哮喘的发生以及气道高反应性有显著相关［6］。目前有关TGF-β1和ADAM33基因交互作用与汉族儿童哮喘易感性研究尚少见文献报道。本研究采用以医院为基础的病例-对照方法，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性，检测对照组和病例组儿童TGF-β1基因T869C位点和 ADAM33基因V4、T2位点单核苷酸多态性，从遗传流行病学角度探讨两基因的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms，SNPs)与汉族儿童哮喘易感性及严重程度的关系，为筛选哮喘的高危人群提供分子流行病学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2008年3月至2010年10月在新乡医学院第一附属医院呼吸内科和儿科住院及门诊患儿110例，男61例，女49例，年龄3.1～14.6岁，符合全球哮喘防治创议的诊断标准［7］，其中轻中度哮喘63例和重度哮喘47例。同时选择同期住院非呼吸系统疾病患者144例为对照组，对照均无个人及家族哮喘史和过敏史(包括湿疹、过敏性鼻炎、过敏性皮炎)。病例组和对照组间性别构成和平均年龄均无差异，所有研究对象均为来自豫北地区(河南省黄河以北5市)的汉族儿童，并由家长或监护人签署《知情同意书》。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)抗凝管采集受检者外周静脉血2 ml放置-80℃冰箱备用。DNA提取试剂盒购自上海生物工程有限公司，所有操作步骤均按照说明书进行。

1.2.2 基因型检测 通过GenBank查找到编号为rs1982073、rs2787094和rs2280090基因完整序列，采用 Primer premier 5软件包设计 TGF-β1基因T869C位点和ADAM33基因V4、T2位点引物，设计的引物由上海生物工程有限公司合成。三位点的引物及PCR反应退火温度、产物长度及酶切片段见表1。PCR 反应总体积 25 μl，其中 10 × Buffer 2.5 μl，TaqDNA 聚合酶 0.7 U，dNTP 2.5 μl，上下游引物各1 μl，Template DNA 1.5 μl，25 mmol/L MgCl21.8 μl，双蒸水14 μl;PCR 反应条件:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒，一定的退火温度30秒，72℃延伸40秒，共35个循环;72℃终延伸10分钟，最后4℃保存。取10 μl PCR产物，建立总体积为30 μl的酶切反应体系，加入相应的限制性酶 Pst I、Hinf I和PvuⅡ(fermentas基因公司)，37℃温育4小时，65℃水浴15分钟终止反应，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μg/ml)电泳分离，经凝胶成像仪系统处理后进行基因型判读，记录并保存结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件建立数据库并进行统计分析。为考察研究资料的可靠性，所有位点每组分别进行Hardy-Weinberg平衡检验。组间基因型频率和等位基因频率的差异性比较采用χ2检验。基因多态性与哮喘患病风险的关联程度采用比值比(OR)及其95%可信区间(CI)描述。采用MDR(version 1.1.0)软件分析SNP间交互作用。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 样本的Hardy-Weinberg平衡检验 三位点在各组的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明本次抽样具有代表性。TGF-β1基因T869C位点对照组(χ2=0.033，P=0.402)，病例组(χ2=1.584，P=0.856);ADAM33基因 V4位点对照组(χ2=0.823，P=0.396)，病例组(χ2=0．036，P=0.849);T2位点对照组(χ2=0．703，P=0.402)，病例组(χ2=1．584，P=0.208)。

2.2 TGF-β1和ADAM33基因多态性位点与儿童哮喘相关性分析 由表2可见，T869C多态性位点的基因型和等位基因频率在哮喘各组与对照组之间的分布差异均无统计学意义。哮喘各组中V4位点C等位基因频率均高于对照组(P＜0.01)，C等位基因携带者患哮喘的危险性是G等位基因的2.36倍(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56)，T2位点 A 等位基因频率在哮喘各组中的分布均高于对照组(P＜0.01)，A等位基因携带者患哮喘的危险性是G等位基因的2.96倍(OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。V4位点CC基因型分布在对照组与轻中度哮喘组无差异外，余在各组中分布差异均有统计学意义(P＜0.05);T2位点除GA基因型分布在对照组与轻中度哮喘组、AA基因型分布在对照组与重度哮喘组无差异外(P=0.084、0.063)，其余在各组中分布差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 候选多态性位点的引物、PCR产物长度及酶切片段Tab．1 Candidate polymorphisms，polymerase chain reaction(PCR)，Annealing temperature，PCR product sizes，restriction enzymes and digested fragment size

2.3 多态性位点之间的MDR交互作用分析 将数据进行交互作用分析，目的在于找出与儿童哮喘发病显著相关的基因与基因的交互作用，在一至三阶模型中发现2个位点最佳模型仅包含ADAM33基因位点V4和T2;3个位点最佳模型包括了T869C、V4和T2。两模型哮喘组和对照组比较均有统计学差异(P＜0.05)，交叉验证一致率均为100%。见表3，模型的单元格划分及组合情况见图1。

表2 ADAM33和TGF-β1基因型及等位基因频率在对照组与哮喘组、不同程度哮喘组的分布Tab．2 Distribution of genotype and allele frequencies for ADAM33 and TGF-β1 between controls(CTR)and total patients with asthma(TA)，patients with moderate asthma(MA)，and patients with severe asthma(SA)

表3 ADAM33和TGF-β1基因交互作用的MDR模型Tab．3 MDR models of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

图1 ADAM33和TGF-β1基因多态性位点交互作用的图解模型Fig．1 Graphical representation of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

3 讨论

ADAM33是2002年首个通过定位克隆发现的哮喘易感性基因，因其与支气管哮喘密切相关而成为近年来的研究热点。先后多个研究小组对不同种族人群ADAM33基因单核酸多态性位点进行了检测，而研究结果不尽一致，Qu等［8］研究表明 ADAM33基因的T+1、T1、V4可能参与了中国北方汉族儿童哮喘的发病过程。Nallur等［9］则在印第安人群进行的一个病例对照研究中没有发现ADAM33基因多态性与儿童哮喘存在相关性。基于哮喘在具有不同遗传背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因与各种环境因素作用而导致哮喘发生，本研究选择ADAM33基因V4、T2位点探讨中国豫北地区汉族儿童该基因多态性和哮喘病的关系。

本组资料结果显示，哮喘组ADAM33基因V4位点C等位基因和T2位点A等位基因频率显著高于对照组，提示C、A等位基因可能增加儿童哮喘的发病风险(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56;OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。将哮喘患儿分为轻中度和重度对照研究发现，重度哮喘组V4位点CC基因型频率高于对照组，轻中度和重度哮喘组GC基因型频率高于对照组，表明C等位基因可能同时影响儿童哮喘发病严重程度，当然也有学者得出不同的结论［10］，究其原因可能与种族、样本量大小及环境暴露因素有关。结果还显示T2位点GA基因型仅与重度哮喘有关，AA基因型仅与轻中度哮喘有关，而GG基因型可能使哮喘的发病风险降低，这与Jie等［11］的研究相一致。本资料提示V4、T2位点多态性不仅与豫北地区汉族儿童哮喘的发生有关而且影响哮喘严重程度。

TGF-β1基因T869C位点C置换T后导致蛋白质第10号位置的氨基酸由亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，进而影响到TGF-β1的分泌和表达。文献资料显示，TGF-β1能调节气道炎症和加速气道重塑，增加气道阻力，影响哮喘发病过程［12］。也有研究得出相反的结论，Wisniewski等［13］就未发现T869C与波兰人哮喘病的发生有关。本组资料显示T869C位点基因型及等位基因频率在哮喘各组与对照组间均无差异，这表明该多态性位点与豫北地区汉族儿童哮喘的发生及其严重程度无明显相关性。

基因-基因交互作用分析是目前遗传流行病学研究的热点问题之一，MDR方法作为一种非参数、不受遗传模式影响的分析方法，被成功用于分析多因素相关的复杂疾病研究。虽然 TGF-β1基因T869C位点基因型在哮喘组和对照组之间分布无差异，经过MDR分析提示，ADAM33基因V4、T2位点与TGF-β1位点 T869C具有明显交互作用，推测V4、T2、T869C三位点对哮喘发病可能具有累计效应。哮喘是一种多基因遗传疾病，发病机制涉及多条生化通路，单个基因或位点在其发病中的作用难以得到证实，同时针对多基因多位点的研究可能更具有意义。

1 Cookson W.The alliance of genes and environment in asthma and allergy［J］.Nature，1999;402(6760 Suppl):B5-B11.

2 Wan Y Y，Flavell R A.‘Yin-Yang'functions of transforming growth factor-βand T regulatory cells in immune regulation ［J］.Immunol Rev，2007;220:199-213.

3 Rosenbloom J，Jimenez S A.Molecular ablation of transforming growth factorβ signalling pathways by tyrosine kinase inhibition:the coming of a promising newera in the treatment of tissue fi brosis［J］.Arthritis Rheum，2008;58(8):2219-2224.

4 Li H，Romieu I，Wu H et al.Genetic polymorphisms in transforming growthfactor beta-1(TGF-β1)and childhood asthma and atopy［J］.Hum Genet，2007;121(5):529-538.

5 Van Eerdewegh P，Little R D，Dupuis J et al.Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness［J］.Nature，2002;418(6896):426-430.

6 Howard T D，Postma D S，Jongepier H.Association of a disintegrin and metalloprotease 33(ADAM33)gene with asthma in ethnically diverse populations［J］.J Allergy Clin Immunol，2003;112(4):717-722.

7 Bateman E D，Hurd S S，Barnes P J et al.Global strategy for asthma management and prevention:GINA executive summary［J］.Eur Respir J，2008;31(1):143-178.

8 Qu S，Sun D，Wang Y et al.Association of ADAM33 polymorphisms with childhood asthma in a northern Chinese population［J］.Experimental and Molecular Pathology，2011;91:775-779.

9 Nallur M B，Mahesh R，Pradeep S M et al.Association of IL-4 and ADAM33 gene polymorphisms with asthma in an Indian population［J］.Lung，2010;188:415-422.

10 Thongngarm T，Jameekornrak A，Limwongse C et al.Association between ADAM33 polymorphisms and asthma in a Thai population［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，2008;26:205-211.

11 Jie Z，Hu Z，Bai et al.ADAM33 gene polymorphisms associate with asthma susceptibility and severity in east China Han Population［J］.J Asthma，2011;48(10):979-985.

12 Mak J C，Leung H C，Ho S P et al.Analysis of TGF-β1 gene polymorphisms in Hong kong Chinese patient s with asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2006;117(1):92-96.

13 Wisniewski A，Obojski A，Pawlik A et al.Polymorphism of the TGFB1 gene is not associated with bronchial allergic asthma in a Polish population［J］.Hum Immunol，2009;70(2):134-138.