β-萘并冠醚卟啉的合成及光敏活性

黄齐茂，李 清，王司卫，潘志权

(武汉工程大学 绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430073)

光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是一种以光、光敏剂和氧的相互作用为基础的癌症治疗方法[1]。其中光敏剂是光动力疗法的关键所在[2]，光敏剂对肿瘤组织具有选择性，可在光照下产生单线态氧杀伤降解肿瘤组织。卟啉类化合物作为应用于PDT治疗与诊断的光敏剂，其结构具有刚性，可较好地控制其周边官能团的方向和位置[3, 4]；冠醚是一种人工合成的受体，分子具有疏水性的外部骨架，又有亲水性内腔[5]。因此，作者设计在中位四苯基卟啉的β-位引入冠醚基团，通过对β-(2,3-二羟基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉进行修饰合成Annulated型[6]冠醚卟啉，并研究了其光敏活性。

1 实验

1.1 试剂与仪器

所用试剂和溶剂均用标准方法纯化。柱层析硅胶(200～300目，100～120 ℃活化 1 h)，青岛海洋化工厂；三羟甲基氨基甲烷-乙酸/盐酸 (TAE/TBE) 缓冲溶液(pH=7.4，0.05 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1NaCl)；溴酚蓝、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、pBR322质粒DNA，日本Toyobo公司；小牛胸腺DNA(ct-DNA)、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)，华美生物工程公司。

Trace GC-MS质谱仪，美国Thermo Finnigan公司；204B型元素分析仪，美国Perkin-Elmer公司；Mercury 300型超导核磁共振仪，美国Varian公司；FTIR-8100型红外光谱仪、UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；DYY-8B型稳流稳压电泳仪，南京普阳科学仪器研究所；Lourmat Bio Print-1000型凝胶成像分析系统，法国Vilber公司；高压汞灯(波长范围350～800 nm，50 W)，西安教学仪器厂。

1.2 方法

β-(2,3-二羟基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成参照文献[7]。β-(2,3-二羟基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉合成路线见图1。

图1 β-(2,3-二羟基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成路线

1.2.1 化合物Ⅲ的合成

称取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅰ投入100 mL的三口烧瓶中，加入50 mL无水DMF溶解，氩气保护并电磁搅拌，升温至100 ℃。取200 mg刚焙烧的碳酸钠和3 mL(0.24 mmol)双(2-溴乙基)醚加入反应瓶中，TCL监测反应(展开剂:氯仿∶环己烷=1∶1)，反应约36 h。反应停止后加入50 mL水，抽滤干燥得到固体，用硅胶过柱(淋洗剂:氯仿∶环己烷=1∶3)，收集深红色主带第3带，得紫红色固体化合物Ⅲ 107 mg，产率48%。UV-Vis(CHCl3),λmax,nm:423,540;IR(KBr),ν,cm-1:3053(ArC-H),2919,2849(C-H),2757,1441(Ar-H),1440,1343(O-H),1176,1072 (C-O),1004 (Cu-N);MS(GC-MS),m/z:904[M+,100]。

1.2.2 化合物Ⅳ的合成

称取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅱ投入100 mL的三口烧瓶中，其它操作同1.2.1，得紫红色晶体化合物Ⅳ95 mg，产率44%。UV-Vis(CHCl3),λmax，nm:420,549;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.86～8.52(m,7H,Hβ-pyrrolic),8.23～8.03(m,8H,5,10,15,20-HoPh),7.93～7.25(m,12H,5,10,15,20,HmPh,pPh),7.23～6.46(m,5H,Ar-H),4.71～3.53(m,8H,C-H),-2.59(s,2H,N-H); IR(KBr),ν，cm-1:3412,1278(N-H),2959(ArC-H),2927,2872(C-H),1121,1072(C-O),800,746(Ar-H); MS(GC-MS),m/z:843[M+,100]。

1.3 β-萘并冠醚卟啉产生单线态氧能力的测定

将待测卟啉溶液和DPBF混溶于Tris-HCl缓冲溶液中，使卟啉浓度为1 μmol·L-1、DPBF浓度为100 μmol·L-1。取3 mL混合液于比色皿中，用高压汞灯照射(距离为20 cm)，用紫外分光光度计测量溶液在415 nm处吸光度值，以光照时间为横坐标、吸光度为纵坐标作图，比较其产生单线态氧的能力。

1.4 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322质粒DNA的测定

配制1%的琼脂糖(含0.1%的EB)，制成凝胶。将0.5 μL pBR322质粒DNA分别和0.5 μL不同的冠醚卟啉光敏剂混合，在37 ℃下用高压汞灯光照2 h (距离为20 cm)，同时做未光照的对照实验。停止光照后加0.5 μL溴酚蓝，在90 V下电泳1.5 h，用凝胶成像分析系统照相。

1.5 β-萘并冠醚卟啉与ct-DNA滴定的紫外可见吸收光谱测定

取3 mLTris-HCl缓冲溶液分别加入到参比池和样品池中，样品池中加入3 μmol冠醚卟啉溶液(卟啉浓度为1μmol·L-1) 。用紫外分光光度计记录随着ct-DNA浓度的增加，溶液在300～600 nm光谱范围内的特征吸收峰变化情况。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

合成冠醚卟啉的过程中发生了分子内的SN2反应，因此，溶液中加入碳酸钠作为去酸剂使整个反应体系维持碱性，β-二酚卟啉即可形成芳氧负离子，有利于反应进行。反应前通入高纯氩气除去体系中的氧气以避免反应原料的氧化。由于目标产物C-O键与硅胶的吸附较强且有拖带现象，故选择极性较小的展开剂进行分离。当原料为化合物Ⅰ时，第1带为棕褐色，为少量脱去萘酚的5,10,15,20-四苯基硝基卟啉铜；第2带为未反应的β-(2,3-二羟基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉铜；第3带红色主带为目标产物冠醚卟啉铜。当第1和第2带分离出来后，改用氯仿将第3带产物淋洗下来，溶液蒸干得到紫红色固体即为目标产物Ⅲ。

以CDCl3为溶剂的1HNMR图谱中，δ8.86～8.52归属为吡咯环上的氢(7H),δ8.23～7.25归属为卟啉中位苯环上的氢(20H)，δ7.23～6.46归属为萘基上的氢(5H)，δ4.71～3.53归属为冠醚上的氢(8H)，N-H质子化学位移出现在δ-2.59(2H)。红外吸收光谱中3412 cm-1、1278 cm-1处较强的峰归属为N-H伸缩振动峰，2959 cm-1处归属为萘酚上的C-H伸缩振动峰，2927 cm-1、2872 cm-1处归属为C-H的伸缩振动峰，1121 cm-1、1072 cm-1归属为C-O的伸缩振动峰，800 cm-1、746 cm-1处较弱的峰归属为Ar-H的弯曲振动峰。

图2 化合物Ⅲ的高分辨质谱

在高分辨质谱图(图2)中，β-(2,3-二羟基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉铜的分子离子峰出现在904，丰度为100%；卟啉在脱去铜分子后的分子离子峰出现在843，丰度为30%，与目标产物的理论值相符合。 图3为化合物Ⅲ的主要离子碎片峰的数据。

图3 化合物Ⅲ的主要离子碎片峰

2.2 β-萘并冠醚卟啉产生单线态氧的能力

卟啉化合物在光照条件下产生单线态氧产率的高低决定了其光敏能力的大小[8]；DPBF是一种单线态氧捕捉剂。用紫外分光光度计测定卟啉在415 nm处光照不同时间时吸光度的变化，可以判断卟啉产生单线态氧的能力。化合物Ⅲ、Ⅳ作用下DPBF的分解率见图4，曲线的斜率代表光敏剂产生单线态氧的能力。

图4 化合物Ⅲ、Ⅳ作用下DPBF的分解率

从图4可以看出，化合物Ⅲ、Ⅳ的曲线斜率分别为-0.0024、-0.0080。表明β-(2,3-二羟基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉化合物均具有产生单线态氧的能力，其中化合物Ⅲ产生单线态氧的能力相对较弱，这是由于铜是顺磁性金属离子，可明显降低卟啉反应中氧分子的单线态寿命，导致单线态氧产率降低。化合物Ⅳ比相应化合物Ⅱ的斜率(文献[7]值为-0.0078)稍高，表明冠醚卟啉具有明显的产生单线态氧的能力。

2.3 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322质粒DNA

图5为600 μmol·L-1、400 μmol·L-1、200 μmol·L-1、100 μmol·L-1的化合物Ⅳ在光照和无光照的条件下切割超螺旋pBR322质粒DNA的实验结果。

从图5可以看出，化合物Ⅳ在光照下对DNA有一定的切割作用，说明冠醚卟啉在光照下产生的单线态氧能够对DNA产生有效的切割作用，且随着化合物Ⅳ浓度的增大，对DNA的切割作用逐渐增强，浓度为400 μmol·L-1(条带 2)切割效果最好, 浓度继续提高至600 μmol·L-1(条带 1), 切割效果变化不大。

图5化合物Ⅳ分别在不同浓度下对超螺旋pBR322DNA的切割

Fig.5CleavageofsupercoiledpBR322DNAbycompoundⅣatdifferentconcentrations

2.4 β-萘并冠醚卟啉与ct-DNA滴定的紫外可见吸收光谱

由于卟啉化合物的独特结构使其在紫外可见吸收光谱中具有明显的卟啉特征吸收峰(Soret带及Q带)，因此用紫外可见吸收光谱来研究卟啉与DNA的相互作用。

ct-DNA滴定化合物Ⅳ的紫外可见吸收光谱见图6。

1～8,cDNA(×10-5 mol·L-1):0,2,4,6,8,10,12,14

从图6可以看出，随着ct-DNA浓度的增大，化合物Ⅳ的Soret带出现明显的减色，减色率为49%，但红移不明显(△λ=1 nm)。说明化合物Ⅳ与ct-DNA作用后，卟啉的大环π*共轭体系与DNA碱基的大π共轭体系发生了相互作用，表明卟啉分子主要沿DNA双螺旋结构表面的自堆积的外部键合作用[9～12]。

3 结论

以2,3-二羟基萘基四苯基卟啉及其Cu(Ⅱ)配合物为原料，合成了β-(2,3-二羟基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉光敏剂，并检测了该冠醚卟啉的光敏活性及其与DNA的相互作用。结果表明，β-二羟基萘并冠醚卟啉具有明显的产生单线态氧的能力；与DNA的相互作用模式为外部自堆积；其对DNA具有较好的光敏切割效果。

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