以鸡胸软骨为原料提取硫酸软骨素的研究

李燕妮,曹红光

(1.滨州医学院药学院，山东 烟台264003；2.烟台安德利果胶股份有限公司，山东 烟台264000)

硫酸软骨素是一种具有重复二糖单元结构的粘多糖，这些二糖是硫酸化和/或未硫酸化的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺。软骨的蛋白聚糖单体含80～100 个硫酸软骨素链，它与连接蛋白和透明质酸形成大而可逆压缩的流体型聚集物，这些聚集物是软骨能够以最小变形来对抗大负荷必不可少的物质。

临床研究证明硫酸软骨素治疗骨关节炎有较好的疗效[1]。在美国和欧洲，硫酸软骨素不仅直接用作药品[2]；还广泛用于治疗动物(如狗和马)的关节炎；同时也是一种发展迅速的膳食补充剂。硫酸软骨素的来源通常是牛气管软骨和鲨鱼软骨[3]，无法满足迅速增长的需求，因此开发其它硫酸软骨素来源非常重要。鸡胸软骨是一种有潜力的来源，不仅产量很大，且容易收集，便于生产加工。作者在此以鸡胸软骨为原料提取硫酸软骨素，拟为拓宽硫酸软骨素来源提供参考。

1 实验

1.1 原料、试剂与仪器

鸡胸软骨。

木瓜蛋白酶、硼氢化钠、软骨素ABC酶、角质素、角质素酶、鲨鱼硫酸软骨素， Sigma公司。所用试剂均为分析纯。

高速冷冻离心机，德国Heraeus公司；1260 Infinity型液相色谱仪，安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 硫酸软骨素的提取

取鸡胸软骨匀浆后在60 ℃下用木瓜蛋白酶(用量为4 mg·g-1)水解3 h除去蛋白质，为了水解彻底，再次加入木瓜蛋白酶(用量为4 mg·g-1)水解3 h。将水解液离心除去不溶物，在上清液中加入氯化钠溶液(用量为20 mg·mL-1)，缓缓加入2 BV 95%乙醇沉淀多糖，静置4 h，离心，收集沉淀的多糖，溶解后同法再次沉淀，用乙醇洗涤后烘干，测定硫酸软骨素含量和蛋白质含量。

用上述方法，分别处理不同生长时间的鸡胸软骨，每组平行测定3次，取平均值。

1.2.2 硫酸软骨素的纯化

为了除去从鸡胸软骨中提取的硫酸软骨素糖链中残余的氨基酸，先将5.0 g提取的多糖配制成1000 mL的溶液，然后加入终浓度为1 mol·L-1NaBH4作为保护剂，再加入终浓度为0.05 mol·L-1NaOH溶液，在45 ℃下碱解48 h[3]。用盐酸调节pH值至6.5，乙醇沉淀，烘干，得硫酸软骨素，用于硫酸软骨素的鉴别。

1.3 检测方法

采用《中国药典》(2010版)方法测定硫酸软骨素含量。

采用福林酚法测定蛋白质含量。

采用色谱法和凝胶电泳法对硫酸软骨素进行鉴别。

2 结果与讨论

2.1 不同生长时间的鸡胸软骨提取硫酸软骨素

取不同生长时间的鸡胸软骨提取硫酸软骨素，结果见表1。

表1不同生长时间的鸡胸软骨中硫酸软骨素的含量

Tab.1 The chondroitin sulfate content of the chicken keel cartilageat at different growth stages

由表1可知，由不同生长时间鸡胸软骨提取的多糖平均产量为41.2 mg·g-1，其中硫酸软骨素、蛋白质的平均含量分别为73.6%、3.6%，其余组分可能是硫酸盐低聚糖或非硫酸盐多糖等化合物。

2.2 硫酸软骨素的鉴别

2.2.1 色谱分析

纯化后的多糖采用MONO Q色谱柱测定其组分。为了鉴别从鸡胸软骨中提取的硫酸软骨素，用软骨素ABC酶和角质素酶对多糖进行水解[2](因角质素通常是和硫酸软骨素共存的，所以选择角质素酶)。用软骨素ABC酶水解时，样品用软骨素ABC酶的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液在37 ℃处理4 h。用角质素酶水解时，样品用含0.05 mol·L-1盐酸三羟甲基氨基甲烷的角质酶在37 ℃处理4 h。处理后样品的色谱见图1。

a.鸡胸软骨多糖 b.软骨素ABC酶处理后的鸡胸软骨多糖 c.角质素酶处理后的鸡胸软骨多糖 d.鲨鱼硫酸软骨素

由图1可知，鸡胸软骨多糖提取物呈单一对称峰，经软骨素ABC酶酶解后，该峰完全消失，而经角质素酶酶解后只是有所降低。这表明鸡胸软骨多糖主要是硫酸软骨素。

2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

为了验证色谱分析的结果，将同法处理过的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲溶液为0.1 mol·L-1硼酸-0.1 mol·L-1Tris-0.01 mol·L-1EDTA二钠盐溶液(pH值6.3)，结果见图2。

a.鸡胸软骨多糖 b.软骨素ABC酶处理后的鸡胸软骨多糖c.角质素酶处理后的鸡胸软骨多糖 d.软骨素ABC酶处理后的角质素e.角质素 f.角质素酶处理后的角质素

由图2可知，鸡胸软骨多糖经软骨素ABC酶处理后，多糖色带消失；经角质素酶处理后，色带颜色稍浅。表明鸡胸软骨多糖主要是硫酸软骨素,与色谱分析结果一致。

3 结论

以鸡胸软骨为原料，在60 ℃下用木瓜蛋白酶水解除去蛋白质，再用乙醇沉淀获得鸡胸软骨多糖。色谱分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别显示，鸡胸软骨多糖主要是硫酸软骨素，表明鸡胸软骨是可行的硫酸软骨素新来源。

[1] Sato S,Rahemtulla F,Prince C W,et al.Proteoglycans of adult bovine compact bone[J].Connect Tissue Res,1985，14(1):65-75.

[2] Yamada Shuhei,Sugahara Kazuyuki.Potential therapeutic application of chondroitin sulfate/dermatan sulfate[J].Current Drug Discovery Technologies,2008,5(4):289-301.

[3] Michelacci Y M,Horton D S P Q.Proteoglycans from the cartilage of young hammerhead sharkSphyrnalewini[J].Comp Biochem Physio,1989，92(4):651-658.