藏药吉堪明目液毒理研究

红 梅，刘有菊，陈秋红

（1.青海省藏医药研究院 药物研究所，青海 西宁 810003；2.青海高原医学科学研究所 中心实验室，青海 西宁 810012）

吉堪明目液系小檗眼药膏的基础上改变剂型的制剂，原方收载于贡智云丹嘉措的《临床札记·札记精粹》（藏文版），原藏名音译为“目曼接堪”［1］（我们简称为 MMJK），至今已有一百多年的临床应用史，现收载于《卫生部药品标准·藏药》（第一册）［2］，是历代藏医用于治疗眼科炎症和视力模糊等眼部疾病代表性外用药物。为了临床使用方便，我们用现代工艺改进为滴剂。本文主要阐述其毒理学研究，为新药安全性评价和临床应用提供实验依据。

1 材料与试剂

1.1 药物

吉堪明目液由本所工艺室提供，分装于10mL的眼药瓶中，每1mL相当于生药材的0.52g。100℃灭菌30min，置4℃储存备用。

1.2 动物

KM种小鼠，体重18～22g，清洁级，均由青海省实验动物中心提供，合格证号：青医动字第零零一号，家兔，普通级，2～2.5kg，合格证号：兰大动检（10）第034号。

1.3 仪器

电子天平、离心机、石蜡切片机、显微镜（北航医学图象分析管理系统）、全自动生化分析仪 Olympus au 640（日本）、血细胞分析仪Sysmex KX－21N（日本）、电子天平。

1.4 统计学分析

各项指标均用组间比较进行显著性t检验，所有剂量资料以均数±标准差表示。

2 方法与结果

2.1 急性毒性实验［3］

小鼠口服最大耐受量实验：取健康KM种小白鼠60只，禁食16h后，灌胃给予吉堪明目液每1kg体重25mL，每隔6h同样剂量灌胃给药1次，24h共3次，总剂量为75mL体重1kg，相当于生药39g／kg，空白组给予等体积赋形剂。观察给药后小鼠的毒性反应，包括：一般症状、外观、毛色、大小便、摄食情况、自主活动等，以及7d内的死亡情况，并于给药第7天称重。见表1。

表1 给药前后体重变化情况（）

组别 动物只数 给药前（g） 给药后（g）空白组10 18.14±0.67 21.08±1.5710 18.62±0.84 20.02±1.34吉堪明目液

由表说明吉堪明目滴眼液与空白组给药前后体重无显著性差异。

结果可见，小鼠给药后自主活动、毛色、外观、摄食量均正常，未见其他异常反映。在7d的观察期内未见有小鼠死亡，雌雄小鼠的体重均稍有增长和对照组无明显差异，各组小鼠解剖经肉眼观察，给药组小鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、肠等脏器亦无明显改变，和对照组相比无明显差异。

2.2 刺激性实验［4］

2.2.1 短期多次给药眼刺激性实验

健康无眼疾家兔3只，体重在2～2.5kg，3只家兔分别在左眼滴入吉堪明目液0.1mL，被动闭合10s，右眼滴入等体积赋形剂作为对照，各组均每15min点眼1次，连续给药2h。记录给药后6、24、48、72h至7d观察角膜、结膜、虹膜等部位的刺激反应，直至停药后一周，取眼球做病理检查。结果见表2。

表2 吉堪明目滴眼液对兔眼刺激性评分（）

表2 吉堪明目滴眼液对兔眼刺激性评分（）

评价吉堪（15min／time，2h）组 3 左眼 均正常 0组别 动物只数 眼别 角、虹、结膜反应 分值 眼刺激性无刺激性赋形剂对照组 3 右眼 均正常 0 无刺激性吉堪（3次／d，7d）组 3 左眼 均正常 0 无刺激性赋形剂对照组 3 右眼 均正常 0无刺激性

2.2.2 7天常规给药眼刺激性实验

健康无眼疾家兔3只，体重在2～2.5kg，分别在左侧眼睛滴入吉堪明目液0.1mL，被动闭合10s，右眼滴入等体积赋形剂作为对照，每天3次，连续7天，实验第2天起每日给药前观察角膜、结膜、虹膜等部位的刺激反应，直至停药后一周，取眼球做病理检查。结果见表2。

结果可见：给予吉堪明目液3只短期多次和7d常规给药未出现明显的刺激反应；结膜无充血、无水肿、无分泌物；角膜无混浊；虹膜正常。根据眼刺激实验评分反应分级均为0级，病理组织检查，眼角膜实质层和眼前房内无炎症反应和其他改变。

2.3 长期毒性实验

2.3.1 实验方法

取健康无眼疾家兔32只，雌雄各半。体重2～2.5kg。按性别和体重随机分空白对照组、吉堪明目大剂量（1g／mL）组、吉堪明目中剂量（0.52g／mL）组和吉堪明目小剂量组（0.26g／mL）4组，每组8只。给药组双眼滴受试药0.1mL（2滴），每日4次，连续6周，空白对照组给等体积的赋形剂。30d后，将半数动物麻醉后，经腹主动脉取血，按《新药毒理学研究指导原则》（简称《指导原则》要求［5］，作血液学和生化指标测定，最后处死动物作尸检，取脏器称重和计算脏器系数，另外取眼球、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺及称重并取病理组织切块于4%甲醛溶液中固定，经石蜡包埋、纤维切片（4～6μm厚）、脱蜡水化、HE染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固后，光学显微镜下进行组织学观察。剩余的家兔停药，做延迟毒性检测，继续饲养观察15d，然后分别测定生化和血液学各项指标并进行组织形态学观察。主要观察各组织有无细胞变性、炎症和肿瘤的发生等病理学改变，并对典型病变予以照相记录。实验期间每天观察记录动物的外观、双眼、行为活动、饲料消耗以及粪便形状、饮食量、饮水量变化，每周测量体重1次。

2.3.2 实验结果

（1）吉堪明目液对长毒家兔行为、外观等的影响：通过30d的实验观察表明，吉堪明目液各剂量组对家兔的毛色、尿色、粪便、活动情况、外观、饮水和饮食量均无明显影响，和对照组比较无明显差异。

（2）吉堪明目液对长毒家兔体重的影响：实验结果见表3、表4。结果表明：吉堪明目液各剂量组给药30d、停药15d，家兔体重与空白对照组比较无显著差异。

表3 给药期间家兔体重变化情况（）

表3 给药期间家兔体重变化情况（）

注：给药前以及给药30d期间，各组n＝8；停药15d期间，各组n＝4。

组别 剂量（g／mL） 给药前 第1周 第2周 第3周对照组 0 2334.75±158.612413.75±122.24 2444.00±210.07 2492.25±46.063.16 2479.88±203.74吉堪高 1.1 2411.50±95.45 2512.63±70.03 2577.75±90.04 2641.38±109.71吉堪中 0.52 2401.75±82.66 2467.13±91.75 2531.38±103.31 2604.00±108.93吉堪低 0.26 2294.63±92.34 2360.63±75.04 2430.13±6

表4 给药期间家兔体重变化情况（）

表4 给药期间家兔体重变化情况（）

注：给药30d期间，各组n＝8；停药15d期间，各组n＝4。

组别 剂量（g／mL） 第4周 第5周 停药1周 停药2周对照组 2546.88±225.402621.63±251.01 2734.00±3036.71 2873.25±76.96.45 2828.00±325.96吉堪高 1.1 2716.13±131.202796.00±153.87 2909.75±172.88 3002.75±193.22吉堪中 0.52 2680.13±130.402759.63±150.49 2864.25±175.57 2957.50±196.82吉堪低 0.26 2571.50±41.92 2648.63±53.04 2777.25±5

（3）吉堪明目液对家兔大鼠脏器比重的影响：脏器体比系数：脏器质量／体质量×100%，实验结果见表5、表6。

结果表明：吉堪明目液各剂量组给药30d、停药15d，家兔脏器系数未见明显改变，和空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

（4）吉堪明目液对长毒家兔血液生化指标的影响：实验测定了家兔血液ALT、AST、Cr、BUN、TP、ALB。结果见表7、表8。

结果可见，吉堪明目液各剂量组给药30d后、停药15d家兔血液生化各指标未见明显的影响，和对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表5 给药30d脏器体比系数变化情况（）

表5 给药30d脏器体比系数变化情况（）

组别 心／体 肝／体 脾／体 肺／体 肾／体 肾上腺／体0.3930±0.03410.5856±0.06110.0215±0.0019吉堪高 0.2155±0.02292.8395±0.12720.0652±0.05590.3664±0.01990.5635±0.04150.0214±0.0018吉堪中 0.2240±0.02312.8463±0.11980.0774±0.00480.3636±0.02300.5363±0.02870.0215±0.0044吉堪低 0.2332±0.00792.8650±0.16610.0660±0.0161空白 0.2243±0.01212.8798±0.14020.0741±0.00410.3860±0.01130.6011±0.02530.0233±0.0018

表6 停药15d脏器体比系数变化情况（）

表6 停药15d脏器体比系数变化情况（）

组别 心／体 肝／体 脾／体 肺／体 肾／体 肾上腺／体0.3792±0.03870.5660±0.06880.0223±0.0028吉堪高 0.2111±0.02502.7449±0.11590.0848±0.00960.3555±0.01910.5453±0.04010.0217±0.0020吉堪中 0.2193±0.02062.7723±0.12540.0780±0.00480.3537±0.02180.5210±0.02850.0224±0.0044吉堪低 0.2240±0.00662.7396±0.18140.0717±0.0071空白 0.2183±0.01302.7626±0.18200.0829±0.01790.3690±0.01060.5746±0.02790.0224±0.0010

表7 给药30d家兔的血液生化指标（）

表7 给药30d家兔的血液生化指标（）

组别 丙氨酸氨基转移酶ALT（U／L）天门冬氨酸氨基转移酶COT（U／L）总蛋白TP（g／L）白蛋白ALB（g／L）肌酐Cr（μmol／dL）尿素氮（mmol／dL）4 153.75±3.77 4.18±0.25吉堪高 52.50±4.20 83.25±4.11 54.50±3.70 41.50±2.65 151.50±2.65 4.45±0.35吉堪中 52.75±3.30 80.75±2.50 54.75±1.71 42.00±2.94 152.00±3.16 4.48±0.42吉堪低 53.25±3.30 83.00±3.16 55.5±3.87 42.75±3.40空白 51.50±2.65 82.75±3.77 53.75±4.43 44.00±5.9152.75±4.11 4.38±0.33

表8 停药15d家兔的血液生化指标（）

表8 停药15d家兔的血液生化指标（）

组别 丙氨酸氨基转移酶ALT（U／L）天门冬氨酸氨基转移酶COT（U／L）总蛋白TP（g／L）白蛋白ALB（g／L）肌酐Cr（μmol／dL）尿素氮（mmol／dL）2 155.00±3.56 4.53±0.442 151.75±3.10 4.63±0.28吉堪高 53.75±4.57 80.50±3.11 52.25±2.63 41.50±2.65 151.50±3.11 4.58±0.33吉堪中 52.50±3.87 81.25±4.57 54.00±4.24 41.25±2.50 155.25±3.30 4.60±0.26吉堪低 55.25±3.86 83.75±4.57 53.75±4.03 42.00±3.9空白 55.50±1.29 79.25±5.44 53.50±3.11 43.25±2.2

（5）吉堪明目液对长毒家兔血象的影响：实验测定了大鼠的 Hb、RBC、WBC、PC实验结果见表9、表10。

结果表明：吉堪明目液各剂量组给药30d、停药15d，与对照组相比家兔血象无显著差异（P＞0.05）。

表9 给药30d家兔的血象变化（）

表9 给药30d家兔的血象变化（）

组别 红细胞（1012／L） 血红蛋白（g／L） 血小板（109／L） 白细胞（109／L）35吉堪高 5.25±0.37 103.00± 2.58 641.00±2.58 17.30±0.37吉堪中 5.20±0.22 103.75±3.30 642.50±3.42 17.18±0.50吉堪低 5.18±0.41 102.50±1.29 642.67±2.65 17.10±0.空白 4.88±0.28 104.75±3.10 642.00±1.83 17.08±0.32

表10 停药15d家兔的血象变化（）

表10 停药15d家兔的血象变化（）

组别 红细胞（1012／L） 血红蛋白（g／L） 血小板（109／L） 白细胞（109／L）60吉堪高 5.13±0.17 103.25±0.96 642.50±3.42 17.48±0.56吉堪中 5.18±0.22 104.00±1.83 643.25±3.59 17.45±0.62吉堪低 5.15±0.21 106.75±1.71 643.50±3.51 17.55±0.空白 4.95±0.13 105.00±1.63 636.25±6.80 17.15±0.68

（6）吉堪明目液对长毒家兔主要器官组织形态学的影响：经对全部抽取的256个器官组织的全面观察，结果为：

眼球：64组眼球的角膜上皮细胞未见坏死脱落，角膜基质层未见异物及血管，胶原纤维排列整齐，角膜内皮完整；虹膜前缘层、基质层和上皮层结构清晰，其中瞳孔括约肌和开大肌排列整齐；睫状体上皮、基质和其中的睫状体肌结构如常；晶状体表面薄层均质状晶状体囊及单层立方状上皮未见破环，深部晶状体纤维排列整齐；视网膜色素上皮层、视细胞层、双极细胞层和节细胞层厚度适中，排列整齐；视网膜外为脉络膜和巩膜，其结构未见异常；眼球后方可见完整的视神经。给药组和对照组眼球各组织结构均未见炎症、异常增生和肿瘤性改变。

心：32组心脏的心外膜、心肌膜和心内膜结构完整，心肌细胞无肥大及萎缩，心肌膜内肌原纤维排列整齐，横纹明显，心外膜的间皮细胞、心内膜的内皮细胞和心肌细胞均未见明显的变性、坏死和增生，心脏各层间质均未见炎症细胞浸润。

肝：32组肝组织，肝小叶结构完整，中央静脉位于小叶中央，周边肝细胞索呈放射状规则排列，肝血窦无明显缩窄或增宽，肝细胞未见明显的气球样变性、脂肪变性和嗜酸性变；未见区带状坏死、碎屑样坏死；未见肝细胞淤胆和胆栓形成。未见内皮细胞、枯否氏细胞增生。汇管区无扩大，未见纤维组织增生。

脾：32组脾脏被膜未增厚，脾小梁未增宽，分布规则及均匀，红髓、边缘区和白髓结构清楚，脾血窦无扩张及淤血，淋巴小结未增多，生发中心大小适中。

肺：32组肺组织肺泡大小一致，肺泡间隔薄厚适中，无纤维组织增生，无血管扩张充血和水肿，细支气管及其周围、肺泡内和肺泡间隔未见明显的炎症细胞浸润和其它炎性渗出物。

肾：32组肾脏被膜厚度适中，皮质和髓质界限清楚，肾小球未见萎缩或代偿性肥大，近曲小管和远曲小管上皮细胞未见细胞水肿（颗粒变性）、透明变性和坏死，集合管各属支和肾间质均未见炎症反应。

肾上腺：32组肾上腺被膜完整，皮质和髓质界限分明，球状带、束状带和网状带分层清楚，均未见明显的变性、坏死、增生和炎症细胞浸润。

3 结论

本藏药是由小檗膏、诃子、红花、冰片、熊胆粉、麝香组成，有消炎止痛的作用，用于目赤痒痛、流泪、沙眼等眼病。临床效果肯定，西藏自治区藏医院对米乃刚擦（眼部干涩症）临床病历统计30例，眼部点小檗眼药膏，每天4次。结果：痊愈30例，总有效率100%；对若日托嘛（视疲劳）病历统计20例，患者眼部用小檗眼药膏每天点5次。疗程1周，结果：痊愈15例，好转5例，总有效率90%。通过此项目支持改为滴剂后，观察吉堪明目液对小鼠灌胃最大耐受量39g／kg未发生任何不良反应；对家兔短期多次给药眼刺激（1次／15min，连续 滴眼 2h）和常规治疗7天（3 次／d，0.1mL／次）给药刺激性试验对兔眼观察均无明显影响，双眼角膜透亮，无混浊，虹膜纹理清晰，结膜无充血，无水肿，无分泌物；病理组织检查眼球角膜、虹膜、睫状体、晶状体、视网膜、视神经等组织结构正常，无病理学改变；对家兔连续滴眼30天（4次／d）及停药15天外观行为、每周体质量、血液学和血液生化学、脏器系数与空白组比较无明显差异，病理检测眼球角膜实质层和眼前房内无炎症反应和其他改变；心、肝、脾、肺、肾、肾上腺无明显药物性病变。综上所述，本藏药新制剂未发现毒性反应，其临床应用安全，无刺激性。

［1］贡智云丹嘉措.《临床札记·札记精粹》［M］.第1版.民族出版社，2005：146.

［2］中华人民共和国卫生部药典委员会.药品标准藏药第一册［S］.1995：266.

［3］徐叔云，等.药理试验方法学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2001：227－230.

［4］林琪玲.抗毒复命滴眼液的急性毒性与眼部刺激实验研究［J］.深圳中西医结合杂志，2008，（18）4：212－214.

［5］中华人民共和国卫生部药政局.新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、药理学、毒理学）［M］.北京：人民卫生出版社，1993：198－208.