岩大戟内酯B对人卵巢癌Skov3细胞的增殖抑制作用

周珊珊，许宗斌，鲁 伟

(贵阳市肺科医院 药剂科，贵州 贵阳 550003)

卵巢癌是一种常见的妇科肿瘤，尽管发病率位于子宫癌之后，但死亡率居于妇科肿瘤首位，严重影响患者的生活质量和生育能力［1］。除手术切除外，化疗是常用的治疗手段，但长期使用毒副作用大，因此需探讨有效的治疗方法［2］。狼毒大戟是一种含二萜醇类化合物，对多种恶性肿瘤有较好的治疗效果，如肺癌、胃癌及肝癌等，且未发现长期化疗的不良反应［3-4］。岩大戟内酯 B(Jolkinolide B，JB)是狼毒大戟的主要成分［5］，研究表明其可通过抑制PI3K/Akt信号通路来诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡［6］。提示JB可用于恶性肿瘤的治疗。但目前对JB能否抑制卵巢癌的研究较少，因此本研究给予人卵巢癌Skov3细胞JB处理，观察对其增殖的影响，为临床卵巢癌的治疗提供依据。

1 材料

JB(纯度≥98%)，上海惠诚生物科技有限公司;LY294002(PI3K抑制剂)，美国Sigma公司;人卵巢癌Skov3细胞，美国ATCC;二甲亚砜(DMSO)、TritonX100、胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶，美国 Gibco公司;β-actin、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠二抗、兔二抗单克隆抗体，美国Santa Cruz 公司;Akt、P-Akt(Ser473)、Bax、Caspase-3 和Bcl-2多克隆抗体，美国Cell Sigaling Technology公司;其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 细胞传代培养

将人卵巢癌Skov3细胞接种于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基60 mL中。培养2～3 d后，置于倒置显微镜下观察，待细胞形态为致密单层时，移除培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，用37℃预热的0.25%胰酶消化细胞1 min左右，待细胞呈现圆形时，加入少量RPMI 1640培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，并采用RPMI 1640培养基重悬细胞，按5×105/mL将卵巢癌Skov3细胞接种到培养瓶中，在37℃、5%CO2下培养。

2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率

以5×104/mL将Skov3细胞接种于96孔培养板(100 μL/孔)，采用不含血清的 RPMI 1640 培养基稀释 JB 分别至 0.1，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μmol/L，每组设6个平行样本，同时设立阴性对照组(不加药);培养72 h后向每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，孵育4 h后终止培养，在酶标仪上测量在490 nm波长处的吸光度(A)值，重复3次。计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率 =［1－(A实验组/A阴性对照组)］×100%。

2.3 细胞凋亡指数

将小玻片(高压灭菌处理)预先置于培养板底部，将Skov3单细胞悬液接种于培养板中，待细胞贴壁后弃掉培养基，并加入不加药培养基(对照组)、含 20.0 μmol/L JB 培养基(JB 组)、含 30.0 μmol/L LY294002 培养基(LY294002 组)和含 20.0 μmol/L JB+20.0 μmol/L LY294002 培 养 基 (JB+LY294002组)，处理24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞爬片，PBS冲洗 3次后，加入 5 μg/mL Hoechst 33342染色，室温下反应30 min后采用荧光显微镜观察形态，于每组随机选取5个高倍镜视野计数凋亡细胞数和总细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

2.4 全蛋白提取

收集对数期细胞并用预冷的PBS清洗3次，吸干后加入全蛋白提取缓冲液0.5 mL，于冰上裂解15 min;在多次刮取细胞后通过吹打使细胞悬浮，转移至EP管中，冰上振荡处理15 min;12 000 r/min离心20 min，采用BCA法测定上清液的蛋白浓度，并将蛋白置于－70℃保存。

2.5 Western blot实验

将蛋白样品与加样缓冲液混合，煮沸(100℃ ×5 min)后离心3 min，取等量蛋白加样后进行10%SDS-PAGE电泳。电泳条件:浓缩胶恒压80 V约20 min，分离胶100 V约80 min。半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，按约0.1 mL/cm2的量加适量一抗，Akt、P-Akt(Ser473)的稀释比例为 1∶200，Bax、Caspase-3和Bcl-2caspase-3的稀释比例1∶400。4℃孵育过夜。PBST漂洗PVDF膜，加入二抗(稀释比例1∶3 000)室温下摇荡孵育2 h，然后用PBST充分洗膜。采用ECL法来显色处理，胶片曝光后观察蛋白的条带，并采用Gel-Pro analyzer分析各显影条带的光密度。除P-Akt(Ser473)的相对光密度表示为P-Akt/Akt外，其余均表示为与β-actin的比值。

2.6 统计学处理

采用SPSS17.0软件包进行数据分析，数据以(x±s)表示，多组之间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两组之间比较采用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 JB处理对人卵巢癌Skov3细胞增殖的影响

分别给予 Skov3细胞0.1～50.0 μmol/L 的 JB处理均可抑制Skov3细胞的增殖，且抑制率呈剂量依赖的方式升高，IC50为 5.28 μmol/L，见图 1。

图1 不同浓度JB对Skov3细胞的增殖抑制率Fig.1 The proliferation inhibition rates of Skov3 cell treated by different concentrations of JB

3.2 JB处理对人卵巢癌Skov3凋亡的影响

20.0 μmol/L JB、30 μmol/L LY294002(PI3K 抑制剂)处理Skov3细胞后的凋亡指数分别为(42.65±5.83)% 和(13.37 ±2.67)%，均高于对照组的(0.77±0.11)%;LY294002可增加 JB 诱导 Skov3细胞凋亡的作用，凋亡指数为(54.61±7.09)%，且与对照组、JB组和LY294002组均有统计学差异(P＜0.05)。Hoechst染色图见图 2。

图2 不同药物处理Skov3细胞后的凋亡图Fig.2 The original apoptotic recording of Skov3 cell treated by different reagents

3.3 JB处理对人卵巢癌Skov3细胞PI3K/Akt信号通路影响

JB刺激后，Akt的Ser473磷酸化位点被抑制，且P-Akt(Ser473)/Akt降低;而LY294002也可降低P-Akt(Ser473)/Akt水平，同时可增强JB抑制Akt的Ser473磷酸化位点的激活，均与对照组有显著差异(P＜0.05)，且各组处理对Akt蛋白总量无影响，见图3～4。

3.4 JB处理对人卵巢癌Skov3细胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白水平的影响

JB处理可增加促凋亡基因(Bax、Caspase-3)的蛋白水平，降低抑制凋亡基因(Bcl-2)的蛋白水平，与对照组和LY294002组有差异;而LY294002可增强JB增高Bax、Caspase-3蛋白水平和降低Bcl-2蛋白水平的作用，且与JB组有差异，见图3～4。

图3 不同药物处理对Skov3细胞各蛋白的影响(Western blot)Fig.3 The influence on different proteins of Skov3 cell treated by different reagents(Western blot)

图4 不同药物处理对Skov3细胞各蛋白相对光密度的影响Fig.4 The influence on the relative optical density of different proteins of Skov3 cell treated by different reagents

4 讨论

JB具有多种生物活性，如诱导乳腺癌MDAMB-231、人类白血病U937细胞凋亡，抑制炎症反应等［7-8］，而在动物实验中也发现JB对裸鼠移植MCF-7乳腺癌有较好的抗肿瘤作用［9］，提示JB具有抗肿瘤的效果。

本研究采用JB刺激卵巢癌Skov3细胞发现可呈剂量依赖的方式抑制细胞增殖，具体表现在其可升高Skov3细胞的增殖抑制率，提示JB可抑制卵巢癌Skov3细胞的增殖。此外，给予20 μmol/L的JB还可诱导Skov3细胞的凋亡，表现为Hoechst阳性细胞数占总细胞的比例高于对照组，这与Lin等［6］发现的JB可诱导MDA-MB-231的结论一致，表明JB对卵巢癌Skov3细胞有较好的抗肿瘤效果。

以往的研究表明，大多数的肿瘤细胞PI3K/Akt通路是激活的，且在肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡中发挥重要作用［10］，而相关研究提示JB可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡［7-8］，因此推测其也可能通过抑制PI3K/Akt信号通路来发挥抗肿瘤的作用。Akt(Ser473)磷酸化位点的激活状态是评价PI3K/Akt信号通路的常用手段［11］。本研究发现，JB可导致Akt(Ser473)水平降低，表明其可抑制Akt(Ser473)磷酸化位点的活化，这与Lin和Wang的研究［6-7］一致。JB诱导Skov3细胞增殖的效果要强于对照组和使用PI3K抑制剂(LY294002)的效应，提示JB除抑制PI13K/Akt信号通路外，还可能有其他机制。

死亡受体途径是细胞凋亡主要途径，当外界刺激导致死亡受体的表达失衡时，即可诱导细胞凋亡，如促凋亡基因表达上调，抑制凋亡基因表达下调等［12-13］。本研究分析JB处理后对常见的促凋亡基因(Bax、Caspase-3)和抑制凋亡基因(Bcl-2)蛋白水平的影响，发现其可上调Bax、Caspase-3的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平，表明JB可激活Skov3细胞的死亡受体途径。

综上所述，大戟内酯B可抑制人卵巢癌Skov3细胞的增殖，促进细胞凋亡，可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路和诱导死亡受体表达来发挥抗肿瘤作用的。

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