重组降血压肽缓释微球对自发性高血压大鼠的降压作用

孙海燕，罗菊珍，刘 冬

(深圳职业技术学院，广东 深圳 518055)

前文制备了重组降血压肽(rAHP，序列为VLPVPR)聚乳酸(rAHP-PLA)缓释微球，并进行了体外释药试验［1］，本文选用自发高血压大鼠(SHR)为实验动物模型，研究了该缓释微球经口服和皮下注射两种给药方式对大鼠血压的影响。

1 材料

rAHP-PLA 缓释微球，自制［1］;rAHP 标准品(序列为VLPVPR，纯度≥99%)，本实验室通过基因工程方法制得。

RM6240BD多道生理信号采集处理系统，成都仪器厂。

SHR和同源正常血压(WKY)大鼠，雄性，12周龄，体质量250～300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SGXK(沪)200920010。

2 方法

SHR和WKY大鼠单笼喂养，自由进水，保持环境温度(24±1)℃，相对湿度(60±5)%，光照和黑暗各12 h。大鼠适应环境7 d后，分别测其体质量和血压。SHR收缩压＞180 mmHg、WKY收缩压＜140 mmHg用于实验。符合实验要求的SHR按体质量和血压均衡随机分组，每组8只。

实验分为口服给药和皮下注射两种给药方式。对于口服给药，SHR分为空白组、原药组和微球高、中、低剂量组，分别一次灌胃生理盐水、rAHP 800 μg/kg，rAHP缓释微球高、中、低剂量(800，400 和200 μg/kg);对于皮下注射给药，SHR分为空白组、原药组和微球高、中、低剂量组，分别一次性皮下注射生理盐水、rAHP 800 μg/kg，rAHP缓释微球高、中、低剂量(800，400 和 200 μg/kg);对于 WKY 大鼠，则分为口服空白组、皮下注射空白组、口服微球组、皮下注射微球组共4组，分别一次性口服或皮下注射生理盐水、口服微球(800 μg/kg)、皮下注射微球(800 μg/kg)。分别测定各组大鼠给药前后不同时间点的尾动脉收缩压变化情况［2-3］。

应用SPSS1110统计软件包进行数据处理，采用重复测量的方差分析比较各组间给药前后的血压变化，组内给药前后的血压变化采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 口服rAHP-PLA缓释微球对SHR大鼠的降压作用

大鼠给药后不同时间的尾动脉收缩压变化见图1。

采用重复测量的方差分析结果表明，原药组和微球组给药前后不同时间大鼠的动脉血压间存在差异(P＜0.01)，同时段各给药组间的血压变化也存在差异(P＜0.01)。微球组给药后血压的变化趋势相同，给药后不同时间与给药剂量间无交互作用(P＞0.05)。

分别进行分组因素单独效应分析和时间因素单独效应分析表明，与空白对照组相比，原药组灌胃给予rAHP原药800 μg/kg 2 h后，SHR血压降至最低点(152.5 ±7.9)mmHg，此后血压逐步回升，给药后8 h，血压回升至(189.9 ± 8.4)mmHg，和空白组相比无显著性差异。微球中剂量和高剂量组给药10 h后，SHR血压均降至最低点，分别为(173.9±8.9)和(161.5 ±10.6)mmHg。此后血压逐步回升，在给药后 36 h，血压分别回升至(189.4 ±6.8)和(181.2±8.3)mmHg，和空白组相比仍有显著性差异(P＜0.05)。微球低剂量组给药后，血压呈现一定的下降趋势，但和空白组相比无显著性差异。

以上分析结果表明，与空白对照组相比，口服给予rAHP-PLA缓释微球中剂量和高剂量4 h后，开始具有降压作用(P＜0.01)，之后随着给药时间的延长降压作用趋于明显，给药后10 h血压降至最低点，至给药后36 h，依然有降压作用。与灌胃给予rAHP原药2 h后降压效果最强且药效持续6 h相比，rAHP-PLA缓释微球显著延长了rAHP的作用时间。

图1 单次口服rAHP-PLA缓释微球后SHR大鼠血压变化Fig.1 Changes of SBP after single oral administration of rAHPPLA microsphere

3.2 皮下注射rAHP-PLA缓释微球对SHR大鼠的降压作用

大鼠给药后0～9 d内不同时间的尾动脉收缩压变化见图2。

采用重复测量的方差分析结果表明，原药组和微球组给药前后不同时间大鼠的动脉血压间存在差异(P＜0.01)，同时段各给药组间的血压变化也存在差异(P＜0.01)。微球组给药后血压的变化趋势相同，给药后不同时间与给药剂量间无交互作用(P＞0.05)。

分别进行分组因素单独效应分析和时间因素单独效应分析表明，与空白对照组相比，原药组皮下注射rAHP原药800 μg/kg 4 h后，SHR血压降至最低点(157.5 ±8.4)mmHg，此后血压逐步回升，给药后48 h，血压回升至(186.7 ±8.5)mmHg，和空白组相比仍有显著性差异(P＜0.01)。微球中剂量和高剂量组给药30 h后，SHR血压均降至最低点，分别为(173.9 ±6.0)和(158.8 ±8.9)mmHg。此后血压逐步回升，在给药后216 h(9 d)，微球中剂量组血压回升至(198.6±6.9)mmHg，给药后 240 h(10 d)，微球高剂量血压回升至(197.2 ±9.2)mmHg，和空白组相比无显著性差异(P＞0.05)。微球低剂量组皮下注射给药后，血压呈现一定的下降趋势，但和空白组相比无显著性差异。

由图2可以看出，皮下注射rAHP标准品4 h后，SHR大鼠的血压出现最低值，药效持续48 h，说明皮下注射rAHP在体内迅速起效，之后随着rAHP的逐渐吸收，药效进一步持续，但48 h后体内药物浓度减少，药效逐渐消失。皮下注射rAHP-PLA缓释微球中剂量和高剂量6 h后开始具有降压作用(P＜0.05)，之后随着给药时间的延长降压作用趋于明显，给药后20 h时血压降至最低点，药效一直分别持续至给药后第9天和第10天，表明与rAHP原药相比，rAHP-PLA缓释微球显著延长了作用时间，具有明显的缓释效果。

图2 单次皮下注射rAHP-PLA缓释微球后SHR大鼠的血压变化Fig.2 Changes of SBP after single dose subcutaneous injection of rAHP-PLA microsphere

3.3 rAHP-PLA缓释微球对WKY大鼠血压的影响

结果见图3～4。可见，单次灌胃及单次皮下注射给予rAHP-PLA缓释微球后，WKY大鼠的血压变化与空白对照组相比基本相同，两者无显著性差异(P＞0.05)，表明rAHP-PLA缓释微球对正常大鼠血压无影响。

4 讨论

图3 单次口服给予rAHP-PLA微球后WKY大鼠血压变化Fig.3 Changes of SBP after single oral administration of rAHPPLA microsphere

图4 单次皮下注射rAHP-PLA微球后WKY大鼠血压变化Fig.4 Changes of SBP after single dose subcutaneous injection of rAHP-PLA microsphere

随着现代生物技术的不断发展，蛋白多肽类药物已逐渐在疾病预防及治疗方面发挥着越来越重要的作用。但与小分子药物相比，此类药物普遍具有稳定性差、生物利用度低、体内生物半衰期短、极易被生物体内的酶分解等缺点，使它们在治疗领域的应用受到很大限制。因此，蛋白及多肽类药物的给药系统已成为现代药剂学研究的热点。目前，可生物降解微球系统被认为是蛋白多肽类药物剂型的改进方向，如注射用缓释制剂，口服及鼻腔吸入剂等。临床研究证明，微球系统不仅能有效防止药物在体内的快速降解，还可以靶向送达体内有效部位，达到缓释目的。本实验室在利用基因工程方法成功进行了rAHP高效表达的基础上，利用生物可降解材料制备得到了rAHP-PLA缓释微球，体外释放实验表明，该微球在pH为7.4的磷酸缓冲液中具有较好的缓释效果［4］。

本文在前期研究的基础上，研究了口服和皮下注射两种给药方式下rAHP-PLA缓释微球对SHR大鼠的降压作用。实验结果表明，口服rAHP-PLA缓释微球中剂量和高剂量(800和400 μg/kg)后4 h大鼠血压明显降低，至给药后10 h药效达到最高，且可以持续36 h。皮下注射rAHP-PLA缓释微球中剂量和高剂量(800和400 μg/kg)后6 h大鼠血压明显降低，至给药后20 h药效达到最高，且可以持续近216 h(9 d)。与单次口服和皮下注射rAHP 800 μg/kg的降压效果相比，可以明显延长作用时间，具有显著的缓释效果。实验结果还表明，单次口服和皮下注射rAHP-PLA缓释微球对WKY大鼠的血压没有影响。

微球给药系统是蛋白多肽类药物传输系统的一个重要的研究方向［5-7］。利用生物可降解聚合物PLA作为骨架材料制备的微球给药系统，能够调节rAHP的释放速度，且微球的空间位阻能够防止胃肠道中酶类与降血压肽的接触，从而保持了多肽药物的稳定性。有利于促进降血压肽的吸收，提高生物利用度，达到缓释的作用。随着生物和制剂技术的发展以及对微球制剂研究的不断深入，多肽及蛋白类药物的临床应用前景也必将越来越广阔。

［1］孙海燕，罗菊珍，刘 冬.重组降血压肽缓释微球的制备与体外释放［J］.中国生化药物杂志，2012，33(4):377-380.

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