PDZ结构域中间序列结合特性及其临床应用

牟 一，蔡鹏飞，高友鹤

(中国医学科学院1.基础医学研究所北京协和医学院基础学院生理与病理生理学系国家医学分子生物学重点实验室，北京100005;2.病原生物学研究所北京协和医学院寄生虫学实验室，北京 100730)

生命体中蛋白质相互作用主要是由结构域来介导。常见结构域(PDZ，SH3，SH2，WW等)的常规结合特性已经较为清楚，如SH2结构域和PTB识别磷酸化的酪氨酸序列，SH3结构域识别多个脯氨酸序列，WW结构域识别PPXY模体，PDZ识别其配体的C末端序列等。近来研究发现这些结构域也可以非常规结合配体蛋白，它们的非常规结合特性被逐渐挖掘，其中PDZ结构域的非常规结合特性就很有代表性，比如，PDZ结构域结合配体的中间序列(internal sequence)，形成PDZ-PDZ聚合体以及与脂类相互作用等［1－2］。我们主要对PDZ结构域结合中间序列这一非常规结合特性及以此为靶点所研发的复合物在临床上的应用作一简要综述。

1 PDZ结构域及常规结合特性概述

PDZ结构域是一类保守的参与蛋白质相互作用的重要结构域，广泛存在于从细菌、酵母、果蝇到高等动植物、后生动物的多种蛋白中，参与诸如细胞信号传导、细胞迁移与入侵、细胞极性、细胞增殖与凋亡、免疫细胞识别等一系列生命活动［3］。PDZ结构域一般由70～90个氨基酸残基组成，在结构上形成5～6个β折叠和2～3个α螺旋，配体蛋白的C末端以反向的β折叠插入到β2和α2形成的疏水性沟槽中［2］。通常，PDZ结构域特异性地识别和结合配体C末端的4～5个氨基酸残基，传统上分成4种结合规律:Ⅰ，－［S/T］－X－Φ*;Ⅱ，－Φ －X－Φ*;Ⅲ，－［D/E/K/R］－X－Φ*;Ⅳ －X－ψ －［D/E］* (X:任意氨基酸，Φ:疏水性氨基酸，ψ:芳香族氨基酸，*:终止密码子)。

2 PDZ结构域中间序列结合特性

除了常规结合配体蛋白的C末端，越来越多的研究支持PDZ结构域也能够结合配体蛋白的中间序列，本综述对其中较明确的实例进行了总结归纳(表1)。PDZ结构域结合的中间序列的方式主要有两类:1)结合配体的一级线性结构;2)通过结合中间序列形成同源或异源二聚体，甚至形成多聚体，形成“节点”丰富蛋白质相互作用网络。

表1 PDZ结构域与其结合的中间序列Table 1 PDZ domains that bind internal sequences

2.1 结合线性的一级结构

PDZ结构域可以通过结合线性的中间序列与配体蛋白作用。研究者运用不同的研究方法在不同物种中发现了PDZ结构域结合中间序列的实例。例如，用核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)证实小鼠蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)Dvl-PDZ可以与膜受体卷曲蛋白(Frizzled，Frz)靠近C末端的保守模体(KTXXXW)结合［8］，还与Idax蛋白的保守模体(KTXXXI)结合［10］。用酵母双杂交技术研究线虫全基因组水平的PDZ结构域的相互作用，发现超过50%的PDZ结构域与配体的作用并不以常规的C-末端结合介导，表明线虫的某些PDZ结构域更倾向于结合中间序列［15］。人的nNOS-PDZ结构域可以识别Vac-14的C末端，也能结合靠近C末端的一段中间序列，通过点突变确定其作用模体为-G-［D/E］-X-Φ-［D/E］-，类似常规的Ⅲ类配体;进一步研究证实，该蛋白质以结合中间序列为主，与C末端序列的结合只起辅助作用［6］。

PDZ结构域之所以能结合中间序列主要是因为βB和αB之间的C-末端结合环(Carboxylate-binding loop)具有一定的柔韧性。例如，果蝇细胞极性蛋白Par-6-PDZ结构域能够结合鸟苷酸激酶蛋白Pals1的N末端线性序列HREMAV0D+1CP，其中的“HREMAV”模拟了常规结合的 C末端序列XEXLV/I-COOH。而Par-6-PDZ结构域的C末端结合环中第1位是脯氨酸，即PLGF而不是常规的GLGF，在与配体Pals-1的中间序列相互作用后发生变形，从而减轻空间位阻。另外，+1位带负电的残基D与C-末端结合环上的带正电的残基K之间形成盐键对两者的结合起重要作用［7］。类似地，hScrib-PDZ4、ZO-1-PDZ1、RIMS2-PDZ结构域中的C末端结合环中的GLGF模体被4个残基隔开或者发生了点突变，形成了更大更柔性的环，使得能与中间序列结合［16］。

2.2 PDZ-PDZ的二聚体

研究发现，PDZ结构域之间可以通过中间序列介导形成二聚体。经典的模型是神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的PDZ 结构域可以分别与突触后密度蛋白(PSD-95)和肌养蛋白结合蛋白(syntrophin，Syn)的PDZ结构域相互作用形成二聚体。利用晶体衍射研究nNOS-Syn相互作用，发现两者之间以“头对尾”的方式结合，其中“头”是指Syn的PDZ结构域的疏水口袋，“尾”是指与之结合的 nNOS的 β 发夹模体［4］;即 nNOS-PDZ靠近N末端处βG-βH之间形成的尖锐的β发夹结构，并模拟常规配体C末端序列的构象，与Syn的PDZ结构域疏水口袋对接(图1)，这种通过结合中间序列的方式是PDZ结构域异源二聚化的另一模型(也可通过二硫键形成PDZ二聚体)，体现了蛋白相互作用网络的复杂性。更重要的是，仅仅靠β发夹结构与疏水口袋的结合并不能形成稳定的复合物，还需要nNOS-PDZ结构域中残基Asp62与其β发夹结构中残基Arg121之间形成盐键稳定β发夹结构，破环这一分子内部的盐键将阻断nNOS与PSD-95或Syn的相互作用。另外，nNOS与PSD-95 PDZ2结构域形成异源二聚体后，其β发夹上的残基Leu107-Phe111变得更加刚性，对稳定复合物起到重要作用［5，17］。

图1 nNOS-Syn的PDZ结构域形成的“头对尾”异源二聚体Fig 1 Head-to-tail heterodimer of nNOS-Syn PDZ domains

膜牵引蛋白GRASP55和GRASP65是高尔基体膜网络的形成两个关键蛋白。最近研究发现哺乳动物高尔基体膜牵引蛋白GRASP55中的GRASP结构域是由两个串联的不规则的PDZ结构域组成，PDZ2结构域中的中间序列(196YGYL199)在分子表面形成尖锐的突出(而非β片层)，与另一GRASP55分子的PDZ1结构域深口袋状凹槽结合，介导形成同型牵引复合物，这一作用模型区别于nNOS与PSD-95或Syn之间的相互作用，是一种新的PDZ结构域结合中间序列的模式［13］。

3 临床应用

从蛋白质组学的角度讲，蛋白质之间一般只有形成相互作用网络才能发挥功能，富含PDZ结构域的蛋白往往是蛋白质相互作用网络中的“节点”，其特异性的关键作用使其成为下一代药物的理想靶标［18－19］，针对 PDZ 结构域设计的小分子抑制剂(如:多肽、化合物等)，可特异性阻断其与特定配体之间的相互作用，为相关疾病的治疗提供新途径［20］。基于PDZ结构域结合中间序列的特性研发的小分子药物或多肽抑制剂已在癌症、中风和抗病毒感染等疾病的治疗上显示出了良好的潜力。

Wnt信号通路在肿瘤发生，胚胎发育，二相轴分化方面起了重要作用，Dvl蛋白介导Wnt信号通路从受体向下游效应分子传递［21］。小鼠Dvl-PDZ结构域能够结合Wnt受体Frz接近C末端的中间序列，突变此保守模体即抑制经典的 Wnt信号通路［8］，由此提示针对Dvl-PDZ结构域设计小分子药物抑制剂具有阻断癌细胞的Wnt信号通路的潜力。在此基础上，研究人员从噬菌体文库中筛选到与人Dvl2-PDZ结构域亲和力最强的多肽pep-N3(EIVLWSDIP)，将其设计成药物多肽来阻断 Wnt/β-catenin信号，该药物多肽具有特异性高，毒性较低的特点，相对于小分子化合物FJ9，不易引起细胞死亡，具有良好的抗肿瘤治疗的潜力［14］。借助于电脑虚拟筛选和NMR波普法，研究者从类药化合物库中筛选到能与mDvl1-PDZ结构域结合且具有良好细胞膜参透性的小分子抑制剂3289-8625，能够阻断Wnt信号通路，并能有效抑制前列腺癌细胞PC3的生长，该化合物的鉴定为新型抗肿瘤药物的设计提供了新的模板［22］。另外，针对Dvl-PDZ结构域拮抗剂的药效基团模型展开配体相似性搜索，可筛选到以更高亲和力与Dvl-PDZ结构域结合的化合物，由此提供更多能有效抑制Wnt信号通路的候选分子［23］。

有研究表明，N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)和 nNOS 的过度活化是脑卒中后神经元细胞死亡的主要原因，直接阻断NMDARs和nNOS能改善神经元的损伤，但有严重的副作用。由脑卒中引起的局部缺血将促进nNOS与PSD95之间的相互作用，而通过过表达nNOS-N1-133则能阻断此相互作用，并有效预防大脑缺血性损伤［17］。基于nNOS-PSD-95之间相互作用的特性，研究人员设计了一系列小分子复合物，从中筛选到一种有效且能避免副作用的小分子药物ZL006。这种药物不仅对大脑缺血有较好的保护作用，而且可以避免直接干预NMDAR或nNOS引起的不良反应，如空间记忆障碍、行为异常等，为脑卒中提供了新的治疗途径［17］。

此外，nNOS与PSD95之间的相互作用也是治疗痛觉过敏的潜在靶点，Florio等研究发现利用小分子抑制剂IC87201和细胞膜可穿透性融合蛋白tat-nNOS(AA1-299)能够特异性阻断 nNOS与PSD95之间的结合，抑制原代海马神经元NMDA-nNOS信号通路，但并不影响nNOS的催化活性;进一步在啮齿类动物模型中的实验表明，上述抑制剂均能有效逆转急性热痛敏和慢性机械性痛敏，为痛觉过敏的治疗提供了新途径［24］。

PDZ结构域结合中间序列可介导病毒与宿主的相互作用。例如，登革病毒(Dengue virus，DENV)非结构蛋白NS5的中间序列与紧密联接蛋白ZO1-PDZ1结合，影响宿主细胞增殖并抑制IFN信号通路［16］。类似地，蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)NS5蛋白的甲基化转移酶结构域可以通过中间序列与人的hScrib-PDZ4结构域作用，从而阻止STAT1的磷酸化，削弱由Ⅰ类和Ⅱ类干扰素介导的 JAK-STAT信号通路［11］。因此，以PDZ结构域结合中间序列的特性为切入点，可以设计特异性好，且副作用小的小分子化合物或多肽药物，用于抗病毒感染的治疗。

4 问题与展望

目前，发现很多PDZ结构域可以结合中间序列，具有一定的普遍性和多样性。PDZ结构域中间序列的结合规律还没有像C末端结合规律那么详尽，还有待于进一步系统研究。这一领域的深入了解，将是对常规结合特性的补充和扩展，是发现新型配体蛋白，丰富蛋白相互作用网络的有效途径之一，有利于发现更多潜在的生命活动机制。基于PDZ结构域结合中间序列的特性研发小分子药物或多肽抑制剂在若干疾病模型中显示出强劲的治疗潜力，但有待于进一步的优化及临床前研究。相信随着研究的深入，会有更多以此为靶点的新型药物得以研发和筛选，用于相关疾病的临床治疗。

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