低氧对结肠癌SW480细胞生存的影响及与细胞自噬的关系

刘雅婷，杨爱军，杨 丽，李双明，向 琳，刘燕菲，李 敏，2*

(1.兰州大学基础医学院病理学研究所，甘肃兰州730000;2.甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州730000;3.兰州军区总医院病理科，甘肃兰州 730000)

肿瘤在宿主中生长，需要宿主提供更多的O2，肿瘤生长的速度远远大于支持它的物质［1］。在此过程中虽然有拟态血管的形成，但肿瘤血管的结构及功能都存在异常，因此氧气和营养物质都相对缺乏，在实体瘤中经常会出现低氧的现象。然而肿瘤细胞却可以在这种微环境中继续生存，特别是一群具有干细胞特性的CD133+细胞(cancer stem cells，CSCs)。

自噬的发生会形成双层膜的自噬体，之后与溶酶体结合，分解胞质中的大分子及细胞器［2］。起初认为自噬同凋亡及细胞坏死一样作为细胞的死亡形式，之后有研究表明自噬为一种新的细胞保护机制以促进肿瘤细胞存活，尤其是在低氧及缺血的微环境中。自噬会因细胞系的不同及肿瘤生长的不同阶段发挥不同的作用。本实验拟研究低氧微环境对结肠癌细胞生存的影响并观察其与自噬之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

结肠癌细胞系SW480由本实验室提供，常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每2天换液传代。将细胞置于氧气含量控制在1%，94%N2及5%的CO2。

1.2 免疫磁珠分选

取10瓶对数生长期结肠癌SW480细胞(细胞数为107个)，胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入300 μL的缓冲液缓冲(0.5%BSA 2 mmol/L EDTA 0.01%PBS)重悬，再加入FCR阻断剂及CD133磁性微珠(Miltenyi公司)各100 μL，充分混匀，置于4 ℃ 暗处避光孵育30 min。加入10～20倍细胞体积的缓冲液洗涤，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入500 μL的缓冲液缓冲重悬。将MS分选柱安装在磁性分选架上，加0.5 mL缓冲液后润洗分选柱将细胞移入MS分选柱中，并加入4倍体积的缓冲液，细胞悬液流出(此时为CD133－细胞)。当液体停止流出时，将分选柱移出分选架，用配套的塞子快速的将剩余液体压入瓶中，此时得到CD133+细胞。

1.3 CD133+细胞体外培养

将分选后的细胞接种于培养瓶中，加入含2%B27、20 μg/L bFGF、20 μg/L EGF 的 DMEM/F12 培养基，每3天加液1次，分别于分选后0、7和14 d倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.4 锥虫蓝染色

称取4 g锥虫蓝，少量去离子蒸馏水研磨，加双蒸水至100 mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。胰蛋白酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合混匀(终浓度0.04%)。在3 min内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染，呈无色透明状。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.5 Boyden小室实验

在Boyden小室的下室中加入200 μL的完全培养液，两室之间放一张孔径为8 μm的多聚碳酸酯膜，膜上均匀铺浓度为3 000 g/L的胶原50 μL，将小室放入37℃、5%CO2聚合30 min。细胞用胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，每个上室内加入浓度为1×105个细胞悬液200 μL，置于对照组正常O2和实验组1%O2的微环境中孵育24及48 h，实验终止后常规HE染色，在200倍光镜下每张膜计数5个视野的穿膜细胞数，计数平均数。各组重复3次。

1.6 电镜观察

用胰蛋白酶消化收集对照组正常O2和实验组1%O2的 SW480细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS冲洗3次，每次5 min，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，氧化丙稀浸润，环氧树脂包埋并制成切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄片。

1.7 MDC荧光检测自噬囊泡

用胰蛋白酶消化，培养基反复吹打并收集细胞，加入50 μmol/L MDC 37 ℃、5%CO2孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，95% 乙醇固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，加入5 μmol/L PI 室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，通风处晾干后，使用倒置荧光显微镜(NiKon)观察并摄片。

1.8 自噬的流式细胞术定量分析

以MDC染色法后，细胞用95%乙醇固定，流式细胞仪以488 nm激发波长，测定MDC染色的荧光强度。

1.9 统计学分析

所有数据采用SPSS16.0统计软件进行处理，组间差异比较采用方差分析，所有指标以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 低氧微环境(1%O2)对结肠癌细胞生存的影响

2.1.1 CD133+细胞体外培养:免疫磁珠分选法得到CD133+细胞，大小均一，圆形，散在分布，悬浮不贴壁。无血清培养48 h后可见部分细胞成团生长，72 h后可形成较小的细胞球，7 d后细胞球逐渐生长，体积变大，14 d时细胞球数量增多且体积增大，半贴壁生长(图1)。

2.1.2 低氧微环境对结肠癌细胞侵袭的影响:SW480细胞在1%O2微环境中24及48 h的穿膜细胞数显著高于常氧(P＜0.05);另外在不同时间相同微环境中48 h穿膜的细胞数显著高于24 h(P＜0.05)(表1)。

2.1.3 低氧对结肠癌细胞活细胞率的影响:与对照组相比，低氧微环境中SW480细胞的活细胞率随着时间的延长而降低(P＜0.05);但对CD133+细胞的活细胞率无显著改变(表2)。

图1 CD133+细胞体外生长情况Fig 1 Growth and proliferation of CD133+CSCs

表1 低氧对结肠癌细胞侵袭的影响Table 1 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+invasion at 24 and 48 hours(±s，%，n=3)

表1 低氧对结肠癌细胞侵袭的影响Table 1 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+invasion at 24 and 48 hours(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with SW480(21%O2)24 hours;#P＜0.05 compared with SW480(21%O2)48 hours.

48 hours SW480 71.00±6.56 134.33±10.50 91.33±6.81* 270.33±10.51 group 21%O224 hours 21%O248 hours 1%O224 hours 1%O2#9.27 CD133+ 43.67±11.24 59.67±4.51 52.00±13.75 56.67±2

表2 低氧对结肠癌细胞活细胞率的影响Table 2 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+viability at 24 and 48 hours(x ±s，%，n=3)

2.2 低氧微环境(1%O2)对结肠癌细胞自噬的影响

2.2.1 低氧微环境中SW480细胞超微结构的变化:与对照组相比，1%O248 h可见到自噬体的形成。即胞质中出现大量独立双层膜结构，且逐渐延伸、弯曲。包含部分胞质成分以及溶酶体等细胞器形成大量双层膜结构的自噬体(图2)。

2.2.2 低氧微环境中结肠癌细胞自噬水平的变化:MDC是一种特异性自噬标志物，自噬囊泡形成后，MDC可被细胞吸收进入囊泡，荧光显微镜下可观察到胞核周发出蓝绿色点状荧光。1%O248 h后，CD133+细胞及SW480细胞均可见到MDC阳性细胞 (图3)。

2.2.3 低氧对结肠癌细胞荧光强度的影响:MDC可以在细胞发生自噬时出现在自噬囊泡中，与常氧微环境中相比，细胞在1%O2微环境中SW480细胞的荧光强度有所降低，而CD133+细胞的荧光强度增加(P＜0.05);但两类细胞均不具有时间依赖性(表3)。

3 讨论

表3 低氧对结肠癌细胞自噬水平的影响Table 3 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+autophagy at 24 and 48 hours(x ±s，%，n=3)

在正常的人体微环境中，动脉血的含氧量为10%～15%，而正常组织中的氧分压较低为3%～6%，在这种氧分压下对正常组织和细胞并没有细胞毒作用［1］。低氧在肿瘤的发生发展中的作用十分复杂，氧气的不足给肿瘤细胞带来多重效应。一方面，肿瘤细胞和其他细胞一样需要运用氧气产生能量以及作为发挥生物效应的基础，这其中包括合成生物大分子，因此低氧的微环境会限制肿瘤细胞的增长，但同时也会选择小部分更加恶性的细胞适应此环境而发生抵抗，这其中就包括CD133+细胞。CD133+细胞为存在于肿瘤组织中具有干细胞特性的一小群细胞，与肿瘤的形成、复发、转移及耐药相关，具有自我更新和分化潜能［3］。对于结直肠癌的常规放疗及化疗可诱发肿瘤细胞发生凋亡，但实际上仅有部分患者对治疗有反应，干细胞理论认为这种情况与肿瘤内部存在少部分CD133+细胞相关［4］。低氧不但可以维持CD133+细胞的表型、促进CD133+细胞自我更新，还可以抑制其向成熟的肿瘤细胞分化［5］;另一方面，肿瘤细胞会有到多余氧气去的倾向性，氧气会诱导肿瘤细胞侵袭转移［6］。

近期有研究显示，在低氧的微环境中会使自噬的发生增加从而发挥对细胞的保护作用，使肿瘤细胞存活［7－8］;也有研究认为自噬的发生与凋亡的作用一致诱导细胞死亡。自噬作用的差异可能与肿瘤生长的不同时期或者相同时期不同的细胞系相关［9－10］。有研究表明，在肿瘤发生的早期，抑制自噬可以导致前癌细胞的持续生长，说明在此阶段自噬具有抑制肿瘤的作用;但当肿瘤细胞持续分裂，快速生长缺乏氧气及营养供给时，自噬的诱发可降解细胞内的蛋白质及细胞器从而为肿瘤细胞的生长提供足够的营养物质，说明此阶段自噬发挥促进肿瘤细胞存活的作用［11］。同样，在同一时期不同的细胞系也会因自噬的发生表现出存活或者抑制现象。因此本研究以低氧及自噬为靶点，探讨两类相关细胞在其中可能存在的不同生存表现。

本实验观察到，低氧的微环境使SW480细胞的数量随时间的延长而减少，CD133+细胞数量基本保持不变，说明低氧使大部分细胞死亡，但同时保护了CD133+细胞中的一部分耐低氧微环境、抵抗力强的细胞，这一小部分细胞符合干细胞特性。在低氧的微环境中观察细胞的侵袭性，大量SW480细胞进入下室，说明此种微环境虽然使部分细胞死亡但残存细胞的侵袭力却是增加的。虽然有文献显示干细胞的侵袭性要强于普通细胞，但在本实验中，低氧状态对CD133+细胞的侵袭性无影响。

运用电镜观察到自噬体的形成，免疫荧光，流式细胞仪观察到低氧微环境中SW480细胞随时间的延长自噬水平下降，而CD133+细胞自噬的水平增加，可能是由于SW480细胞因缺乏营养物质的供给而死亡，在此过程中自噬并没有被激活;在相同的低氧微环境中诱发CD133+细胞发生自噬，并发挥了保护作用，因此CD133+细胞会有一部分继续分化，使肿瘤继续生长。这其中可能正是由于CD133+细胞的存在对肿瘤的继续生长发挥了重要作用。

在实验中低氧诱导SW480细胞死亡，CD133+细胞存活，这两种相反的作用都可能与自噬相关，相同的低氧微环境诱导两类细胞自噬发生的趋势并不相同。同时，SW480细胞会逃离低氧区域，向富含氧气的组织转移，因此在一定区域抗血管治疗可能会促进肿瘤细胞向另一组织尤其是血管中的侵袭转移;那么，是低氧改变自噬的发生还是自噬随细胞类型的不同而发生改变，需要进一步研究。

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