小鼠外周组织时钟基因启动子区甲基化分析

林庆玲，蔡彦宁，袁艳鹏，左晓虹

(首都医科大学宣武医院神经生物室，教育部神经变性病学重点实验室，北京 100053)

迄今哺乳动物多个时钟基因得到了鉴定，包括BMAL1、BMAL2、CLOCK、NPAS2、PER1、PER2、CRY1、CRY2及REV-ERBα等。时钟基因对于生物节律的产生和维持发挥重要作用［1］。哺乳动物时钟基因的节律表达不仅存在于视交叉上核，还存在于外周组织中如心、肝、肾、脾等［2-3］。PER1/PER2，CRY1/CRY2，CLOCK/NPAS2是旁系同源对。同时敲除旁系同源的两个基因引起小鼠的昼夜节律丧失［4］。时钟基因表观遗传调控在外周组织、癌细胞、肿瘤样品以及围产期发育中都有所研究［5-8］，这些研究表明，DNA甲基化可能调控正常机体发育和肿瘤发生中时钟基因的表达。此外，时钟基因甲基化状态与路易体痴呆和老化有关［9-10］。

甲基化特异性聚合酶链式反应(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)是一种鉴定启动子区甲基化状态的简单快速的方法［11］。而今未有关于小鼠时钟基因启动子区甲基化的报道，而小鼠是研究人类发育和老化必不可少的模型，所以应用MSP方法对小鼠时钟基因启动子区进行甲基化检测非常有意义。本实验设计了两套MSP鉴定小鼠时钟基因启动子区甲基化，检测了小鼠5个外周组织 8 个时钟基因 PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1和BMAL2启动子区甲基化状态。

1 材料与方法

1.1 材料

QIAamp DNA mini kit(Qiagen，CA公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司);HS Taq(Takara公司);GelRed(Biotium，CA公司);SssI(CpG甲基化酶New England Biolab公司);引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 动物

清洁级C57BL/6雄性小鼠5只，8周龄，体质量18～20 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK-(军)-2007-004。按如下条件饲养2 周:饮食、饮水自由，08∶00开灯，20∶00关灯，照明:黑暗时间为12 h∶12 h。动物处理按照美国国立卫生研究院动物实验指导方针和首都医科大学实验动物照料和使用委员会指导方针。5只小鼠在09∶00处死，分别获得肝脏、心脏、肾脏、胸腺和睾丸组织。

1.3 基因组DNA提取和亚硫酸氢盐处理

基因组DNA的提取按照QIAamp DNA mini kit说明书进行。偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行修饰，将未甲基化的C转化为U，而甲基化的C保持不变。基因组DNA最初的变性应用0.3 mol/L的NaOH。偏重亚硫酸氢钠与对苯二酚的混合溶液(pH 5.0)与基因组DNA混合50℃孵育16 h。变性DNA的提取按照Wizard DNA purification resin说明书进行。加入0.3 mol/L NaOH在37℃孵育15 min结束反应，乙醇沉淀获得DNA。

1.4 启动子分析和引物设计

时钟基因启动子分析应用在线软件(http://www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)［12］。同一软件设计时钟基因启动子区MSP引物，引物见表1和表2。应用在线软件(http://www.urogene.org/methprimer)分析时钟基因启动子区转录起始位点上下游各600 bp长度序列。

1.5 甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)

偏重亚硫酸氢盐处理的基因组DNA应用HS Taq(Takara，Japan)进行扩增。PCR产物用3%的琼脂糖凝胶电泳，GelRed(Biotium公司)染色。为了确定MSP特异性，SssI甲基转移酶处理的基因组DNA作为阳性对照，未经偏重亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为阴性对照。

1.6 MSP产物序列

PCR产物经北京华大基因研究中心测序。

2 结果

第一套引物检测的8个时钟基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)启动子区均为非甲基化状态(图1)。

第二套引物检测的8个时钟基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)启动子区均为非甲基化状态(图2)。扩增产物与预期片段大小一致。扩增产物经北京华大基因研究中心测序得到进一步证实(图3，4)。

表1 时钟基因启动子区甲基化分析第一套引物Table 1 The first set of primers used for methylation analysis in the promoter of eight clock genes

表2 时钟基因启动子区甲基化分析第二套引物Table 2 The second set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

续表1

图1 8个时钟基因在肝、心、肾、胸腺、睾丸中第一套引物PCR产物电泳图Fig 1 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using set I primers

图2 8个时钟基因在肝、心、肾、胸腺、睾丸中第二套引物PCR产物电泳图Fig 2 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using setⅡ primers

3 讨论

CpG岛存在于启动子区。MSP引物设计用于检测时钟基因启动子区CpG岛的CpG位点。因为甲基化特异性PCR只能检测约3～4个CpG位点，因此容易出现假阴性MSP。为避免这个问题，除了PER1之外每个基因设计了两对引物，用于扩增同一启动子区不同的位点。

甲基化特异性PCR(MSP)是一种简单快速和经济的检查检测CpG岛甲基化状态的方法。对于每个MSP检测，两对引物中一对针对甲基化的DNA(M)，另一对针对非甲基化的DNA(U)。以前的研究表明，肝脏基因组DNA时钟基因启动子区为非甲基化状态［5，13］。因此，偏重亚硫酸氢盐处理的肝脏基因组DNA用于优化U引物对。肝脏基因组DNA依次经Sss I和偏重亚硫酸氢盐修饰处理用于优化M引物对。正确大小的特定的扩增子得到了扩增。每个反应的PCR产物直接测序，鉴定了扩增产物和甲基化状态。

结果表明，所有的CpG位点均为非甲基化状态。作为阳性对照的SssI处理的基因组DNA均能得到扩增。该结果与先前的研究结果一致，表明成年鼠时钟基因启动子区为非甲基化状态。有趣的是，一项先前的研究证明，PER1启动子区存在一些显著的甲基化。而该研究MSP方法鉴定了先前研究的不同的位点。确实，甲基化CpG位点在CpG岛外并在第3和第4 E-box周围［13］。

本研究鉴定了小鼠8个时钟基因启动子区甲基化状态。检测的小鼠外周组织肝、心、肾、胸腺、睾丸中时钟基因启动子区均为非甲基化状态。本研究与先前的研究都表明，在成年小鼠外周组织中，时钟基因启动子区均为非甲基化状态。

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