瘦素及I和Ⅲ型胶原蛋白在肝纤维化大鼠肝组织中的变化

朱 净，潘 亮，许 晶，陆静娴，黄 华，陆翠华

(南通大学附属医院消化内科，江苏南通 226001)

瘦素(Leptin)是一种由肥胖基因编码的分泌型蛋白质，其与肝病的关系受到关注［1］。本实验研究了大鼠肝纤维化发生发展中Leptin及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的变化。

1 材料方法

1.1 试剂:RT-PCR两步法试剂盒 (上海捷瑞)，引物(上海生工)。兔抗大鼠Leptin与Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体 (武汉博士德)。

1.2 动物处理:清洁级60只雄性SD大鼠(150±20 g，南通大学实验动物中心提供，合格证号:2022650)，分为对照组［皮下注射橄榄油溶液(3 mL/kg)］和模型组［给予60%CCl4(V/V)(精制橄榄油配置)3 mL/kg，每周2次，共6周］。每周称体质量1次，根据体质量调整药物用量。第6周模型组大鼠死亡2只。于2、4和6周末分批取对照及模型组肝脏，部分置－80℃冰箱，待作Western blot及RT-PCR检测;另一部分10%甲醛固定，用于病理学观察。

1.3 Leptin与Ⅰ、Ⅲ 型胶原检测:Western blot:肝组织匀浆，裂解后蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转膜后封闭2 h，分别加入Leptin与Ⅰ、Ⅲ 型胶原和β-actin一抗过夜，加二抗孵育1 h后，胶片显影。RT-PCR:引物各一对，Leptin:5'-TGGTCC TATCTGTCCTATGTT-3'，5'-GGAGGTTCTCGCAGGTTCT-3';Ⅰ型胶原:5'-GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3'，5'-GATTGGG ATGGAGGGAGTTTA-3';Ⅲ型胶原:5'-CCACCCTGAACTCAA GAGC-3'，5'-TGAACTGAAAGCCACCATT-3';内参照 GAPDH:5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，5'-TCCACGACATACTCAGC AC-3'，产物大小分别为 286、147、212 及191 bp。Trizol法提总RNA，反转录cDNA后行PCR扩增。产物经电泳，观察条带。将Western blot及PCR条带扫入电脑，以“凝胶分析软件”读取吸光度值(IA值)，Ⅰ、Ⅲ 型胶原与Leptin IA值/β-actin(GAPDH)IA值表示Ⅰ、Ⅲ 型胶原与Leptin蛋白及mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 光镜下结果:CCl4注射第2周时肝小叶小片肝细胞坏死，炎性细胞浸润，轻度纤维组织增生。CCl4注射第4周时肝小叶大片肝细胞坏死，肝细胞呈明显的脂肪变性，胶原纤维由汇管区深入小叶内，但没包裹。CCl4注射第6周时肝细胞变性坏死更加严重，有大量纤维间隔形成。

2.2 Leptin与Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白及mRNA的表达:模型组2、4、6周Leptin与Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白及mRNA表达均逐渐增强(P＜0.05)。在肝纤维化过程中，3者的动态表达呈正相关(P＜0.05)(图1，2，表1)。

图1 Western blot检测Leptin与Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白的表达Fig 1 The protein expression of leptin，collagenⅠ and collagenⅢassayed by western blot

表1 Leptin与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及mRNA在各组中半定量结果Table 1 The semi-quantitation results of leptin，collagenⅠ and collagenⅢ protein and mRNA

图2 Leptin与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达检测结果Fig 2 The gene expression of leptin，collagenⅠ and collagenⅢassayed by RT-PCR

3 讨论

本实验发现，在正常大鼠Leptin仅在少量窦周细胞表达，CCl4注射2周后，Leptin在纤维间隔中的成纤维细胞、肝窦周细胞等肝脏间质细胞开始表达，并随着CCl4注射时间的延长，肝纤维化程度的加重。模型各组大鼠肝组织中Leptin蛋白及mRNA的表达明显增强，至6周时达到最高峰，且Leptin表达与Ⅰ、Ⅲ型胶原呈动态正相关。有研究表明，Leptin可上调肝纤维化Ⅰ型前胶原mRNA的表达，推测增高的Leptin水平可能通过促进TGFβ1的表达，诱导肝星状细胞质活化，促进细胞外基质的合成，导致肝纤维化的发生和发展［2］。因此，Leptin作为一种新发现的细胞因子推测其致肝纤维化机制可能与促进HSC的增殖和活化有关，Leptin可能成为今后药物治疗及预防肝病新的切入点。

［1］Handy JA，Fu PP，Kumar P，et al.Adiponectin inhibits leptin signalling via multiple mechanisms to exert protective effects against hepatic fibrosis［J］.Biochem J，2011，15，440:385－395.

［2］Liu Y，Brymora J，Zhang H，et al.Leptin and acetaldehyde synergistically promotes α-SMA expression in hepatic stellate cells by an Interleukin 6-dependent mechanism［J］.Alcohol Clin Exp Res，2011，35:921 －928.