siRNA干扰CXCR4基因对T24细胞侵袭力的影响

郑湘予，庞 霞，李晟磊，朱志强

1)郑州大学第一附属医院病理科郑州450052 2)郑州大学第一附属医院急诊科郑州450052

CXCR4是G蛋白耦联的7次跨膜蛋白受体，其与特异性配体趋化因子基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)构成的生物学轴激活的特殊信号传导途径，对癌细胞转移至好发部位种植、存活和增殖起关键作用［1］。作者采用RNA干扰技术下调人膀胱移行细胞癌T24细胞的内源性CXCR4表达水平，用Boyden小室体外细胞侵袭模型检测转染siRNA(small interference RNA，siRNA)后细胞体外侵袭能力的变化，以期寻找膀胱癌浸润、转移机制中的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人膀胱移行细胞癌T24细胞株由上海细胞研究所提供。PCR扩增试剂盒购自北京奥科生物技术有限公司，兔抗人CXCR4单克隆抗体购自R＆D Systems公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，siRNA和LipofectamineTM2000均购自广州锐博公司，基底膜基质胶Matrigel matrix购自美国BD公司。Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂。

1.2 CXCR4 siRNA设计、合成及纯化 根据人CXCR4基因序列(NM003467)设计如下序列:CXCR4siRNA:正 义 链 5’-UAAAAUCUUCCUGC CCACC-3’， 反 义 链 3’-AUUUUAGAAG GACGGGUGG-5’;无关序列 dsRNA:正义链 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGU-3’，反义链 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAA-3’。以上siRNA序列均由广州锐博公司合成、纯化。为了避免可能偏靶，采用了严格的BALST进行比对，在GenBank中证实CXCR4 siRNA仅与CXCR4基因存在相应的匹配位点，无关序列dsRNA与任何已知哺乳动物基因无匹配。

1.3 细胞培养和转染 人膀胱移行细胞癌T24细胞株采用无抗生素、含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、体积分数为5%CO2的条件下培养。调整细胞浓度，接种至6孔板，每孔约1×106个细胞。待细胞生长至80% ～90%融合时，采用脂质体LipofectamineTM2000转染，转染步骤严格按照说明书进行。实验分成3组:空白对照组(转染时只加脂质体)，阴性对照组(应采用无关序列RNA转染)，siRNA转染组(采用CXCR4 siRAN转染)，每组设5个复孔。转染前后、倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4 T24细胞CXCR4 mRNA的表达 应用RTPCR检测 。细胞转染72 h后收集细胞，PBS洗涤2～3次，按Trizol说明书操作提取细胞总RNA，取2 μg总RNA用MMLV逆转录酶将其逆转录为cDNA。CXCR4上游引物:5’-AATCTTCCTGCCCAC CATCT-3’;下游引物是:5’-GACGCCAACATAGAC CACCT-3’，产物大小为367 bp;内参β-actin:上游引物:5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’;下游引物:5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，产物大小为480 bp。PCR扩增条件:94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，58℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，共计30个循环，接着72℃继续延伸5 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪成像观察。

1.5 T24细胞CXCR4蛋白的表达 应用Western blot法分析。siRNA转染72 h后收集细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，经电泳、转膜、封闭，依次与CXCR4抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗反应1 h，曝光显影，冲洗胶片，用紫外分光光度计扫描条带灰度值，β-actin作为内参照，以目的蛋白与内参灰度值的比值作为蛋白质表达水平。

1.6 体外趋化侵袭能力检测 收获上述3组细胞，分别用不含胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮，制备单细胞悬液，将细胞数调至5×108L－1。Boyden小室经紫外线照射2 h灭菌，将铺好Matrigel Matrix的膜平铺于下室上，膜上加铺硅胶垫片，并盖好顶板。在上室的微孔中各加入细胞悬液25 μL，每组设3个复孔。37℃、体积分数5%CO2培养箱培养6 h。取出膜，轻轻擦去Matrigel Matrix上未转移至膜上的细胞，将膜用体积分数70%甲醇固定45 min，未结合型苏木素染色5 min，流水冲洗终止反应。光学显微镜下观察迁徙至膜上的细胞，每孔计数5个视野(×100)中的细胞数总和，求其平均值。

1.7 统计学处理 应用SPSS 11.0处理数据，各组T24细胞CXCR4蛋白和mRNA表达、穿膜细胞数比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 siRNA干扰对细胞形态的影响 转染前的细胞均呈贴壁生长，细胞轮廓清楚，生长旺盛;而转染72 h后siRNA转染组细胞集落减少，细胞中颗粒增多，细胞碎片增多，见图1。

图1 siRNA转染组转染前后T24细胞的形态变化(×400)

2.2 各组T24细胞CXCR4 mRNA的表达 见图2、表 1。

图2 各组T24细胞CXCR4 mRNA的表达

2.3 各组T24细胞CXCR4蛋白的表达 见图3、表1。

图3 各组T24细胞CXCR4蛋白的表达

表1 各组T24细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达

2.4 各组T24细胞体外侵袭能力 空白对照、阴性对照、siRNA转染组T24细胞的穿膜细胞数分别为(119.20 ± 7.33)、(117.80 ± 12.15)、(40.80 ±5.02)，3 者比较，差异有统计学意义(F=133.247，P＜0.001)。siRNA转染组T24细胞的穿膜细胞数明显低于空白对照和阴性对照组(P＜0.05)。

3 讨论

膀胱移行细胞癌在我国泌尿系统恶性肿瘤的发病率居第一位。其主要的特点是复发率较高，复发后肿瘤恶性度增高，浸润、转移等恶性行为增强。文献［2］报道50% ～80%的膀胱移行细胞癌患者在第一次术后复发，其中10% ～15%最终进展为浸润性的高度恶性的肿瘤。因此，早期诊断和阻止膀胱癌的侵袭和转移是当前研究的重点和难点。

趋化因子受体CXCR4的天然配体CXCL12是CXC类趋化因子，它们通过耦联G蛋白发挥信息传递作用［3］。研究［4］发现，CXCL12 和 CXCR4 构成的生物学轴在多种恶性肿瘤的发生、进展和转移中发挥重要作用。研究［5］发现人乳癌细胞系高表达趋化因子受体CXCR4，乳癌原发灶及转移灶也高表达CXCR4，而在乳癌最常见的转移部位如肺、淋巴结、肝脏和骨髓则高水平地表达其配体CXCL12。CXCL12/CXCR4在肿瘤浸润转移中的作用亦分别在非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤、恶性黑色素瘤、鼻咽癌等多种肿瘤细胞的研究中得到证实［6-9］。

作者将体外转录合成的CXCR4 siRNA转染T24细胞后，采用RT-PCR和Western blot方法分析靶基因CXCR4 mRNA及蛋白质水平的变化。结果表明，CXCR4 siRNA有效降低CXCR4蛋白和基因的表达。为了检测CXCR4对肿瘤细胞的运动能力和浸润能力的影响，作者采用Boyden小室体外细胞侵袭模型，实验结果发现，siRNA转染组穿膜细胞数与空白对照组和阴性对照组细胞相比明显减少，推测CXCR4基因有促进细胞侵袭的作用。

综上所述，CXCR4在膀胱癌浸润转移过程中发挥重要作用。对CXCR4的深入研究不但能进一步了解肿瘤的生物学行为的变化，还可以为开发新的抗肿瘤药物提供思路。

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