TNF-α基因 siRNA真核表达载体的构建及其对 A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响*

张立英，刘绍霞#，赵国强，张国俊

1)郑州大学第一附属医院呼吸内科郑州450052 2)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001

肺间质纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是多种细胞因子及其网络参与的疾病，以肺组织的慢性炎症、胶原沉积、肺组织结构重塑和慢性纤维组织增生为病理特征，患者最终可因呼吸功能衰竭而死亡［1］，其发病机制尚不完全清楚。PF临床预后差，特别是特发肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，确诊后平均存活时间不超过3～5 a［2-3］。近 年 来 研 究［4-9］发 现 转 化 生 长 因 子-β1(transforming grow factor-β1，TGF-β1)和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)与肺纤维化的发生发展有重要关系。作者利用RNAi技术构建了靶向TNF-α的siRNA真核表达载体，并观察该载体对人肺腺癌A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 A549细胞(美国ATCC公司)，真核表达载pRNAT-U6.1(美国GenScript公司)，限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ(New England Bio Lab公司)，DNA Marker DL2000(上海生工生物工程技术服务有限公司)，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、4×dNTP、逆转录试剂和Real Time PCR试剂(TaKa-Ra公司)，脂质体 Limpofectin 2000TM转染试剂盒(Invitrogen公司)，质粒提取、质粒抽提和DNA胶回收试剂盒(QIAGEN公司)，DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(武汉博士德生物工程有限公司)。凝胶成像系统(美国Syngene公司)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 TNF-α siRNA的设计与合成 根据GenBank中人TNF-α(NM_000594)序列和 Clontech公司的RNAi Designer软件，设计出针对TNF-α的siRNA特异靶序列和无关序列，两端分别加入BamHⅠ、HindⅢ的酶切残基，将上述2对序列标记为siTNF和si-Con。siTNF-F 序列 为 5’-GATCCGGCAGTCAGAT CATCTTCTTTCAAGAGAAGAAGATGATCTGACTGCC TTTTTTA-3’，siTNF-R 序列为 5’-AGCTTAAAAAAG GCAGTCAGATCATCTTCTTCTCTTGAAAGAAGATGA TCTGACTGCCG-3’;siCon-F 序 列 为 5’-GATCCT TCTCCGAACGTCGCACGTTTCAAGAGAACGTGACAC GTTCGGAGAATTTTTTA-3’，siCon-R 序 列 为 5’-AGCTTAAAAAATTCTCCGAACGTCGCACGTTCTCTTG AAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3’。均由博尚生物有限公司合成。

1.3 TNF-α siRNA真核表达载体的构建及鉴定将siTNF和siCon退火成双链，分别重组入载体pRNAT-U6.1，构建成 pRNAT-U6.1-siTNF-α 和 pRNATU6.1-siCon重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选氨苄青霉素抗性克隆，用PCR鉴定后进行DNA测序。

1.4 A549细胞培养及转染 将A549细胞置于DMEM培养基中，于37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中连续培养后铺于6孔板中，当细胞达到80%左右融合时进行转染，分别将脂质体与pRNAT-U6.1-siTNF-α(siTNF-α 组)、pRNAT-U6.1-si-Con(siCon对照组)和 pRNAT-U6.1(pRNAT对照组)质粒DNA按体积比为1∶3混合，另设未转染对照组，室温30 min形成DNA脂质体复合物，分别将转染液铺于6孔板中，6 h后换液，48 h后荧光拍照观察转染情况，收集细胞置于－80℃冰箱备用。每组各设4个复孔。

1.5 A549 细胞 TNF-α 和 TGF-β1 mRNA 的 Real time PCR检测 取收集的细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，以其为模板，逆转录成cDNA，分别以TNF-α、TGF-β1和GAPDH上下游引物行PCR扩增。反应条件:95℃5 min预变性;95℃50 s变性，56℃ 50 s，72℃ 60 s，共循环 30次;72℃延伸 5 min。制作标准曲线，记录各CT值，换算成基因拷贝数，以 TNF-α、TGF-β1与 GAPDH 基因拷贝数的比值作为其相对表达量。引物序列见表1。

表1 Real time PCR引物序列

1.6 A549 细胞 TNF-α 和 TGF-β1 蛋白表达的Western blot法检测 取收集的细胞适量，用预冷的PBS漂洗3次，离心收集细胞，加入裂解液反复吹打。将所得样品在水浴中用超声细胞破碎仪处理，至溶液清澈无黏稠，离心取上清，按体积比1∶1加入样品缓冲液，强力混匀，水浴、离心，取上清。然后经过电泳、转膜、杂交，鉴定膜上的特定蛋白，显色拍照。结果用UMAX扫描仪Magic Scan成像系统采集图像。以GAPDH为内参，用Band scan软件进行分析，以目的基因与内参条带灰度值的比值代表达水平，每组均设4个平行对照。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组细胞中TNF-α和TGF-β1 mRNA和蛋白表达的差异，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 TNF-α siRNA真核表达载体的鉴定 siTNF和siCon退火产物均位于100 bp以下，与设计一致辞，见图1。构建的真核表达载体经DNA序列测定，插入序列与设计序列完全一致。

图1 siTNF和siCon退火产物电泳结果

2.2 各组 A549 细胞中 TNF-α、TGF-β1 mRNA 和蛋白的表达 见图2、表2。

图2 各组A549细胞中TNF-α和TGF-β1蛋白的表达

表2 各组A549细胞中TNF-α、TGF-β1 mRNA 和蛋白表达量的比较

3 讨论

有研究［4-5，8］报道多种细胞因子网络在肺部损伤和炎症后的组织修复中发挥重要作用，尤其是肺泡巨噬细胞(AM)源性细胞因子，如IL-6、IL-8、TNF-α、单核细胞趋化蛋白(MCP)、TGF-β1、血小板源生长因子(PDGF)等，其中最主要的是 TGF-β1和TNF-α。TGF-β1已是公认的致纤维化细胞因子，分泌过多时可启动纤维化，导致肺组织不可逆性损伤。TNF-α是一种前炎症因子［10］，可诱导中性粒细胞和嗜酸性粒细胞产生超氧化物，释放溶酶体酶，介导细胞因子和炎症因子的表达，促进成纤维细胞增殖并产生大量胶原，还可诱导活化AM，使其分化和成熟，表达更多的细胞因子和炎症介质。肺泡上皮细胞上存在 TGF-β1和 TNF-α 合成位点［6-9］。这些都说明它们和肺间质纤维化的发生发展关系密切。有临床研究［11］证实应用TNF-α抗体治疗肺间质纤维化可改善患者的临床症状及阻止肺功能的恶化。

作者在体外合成针对TNF-α的短发卡结构的DNA序列，成功克隆入pRNAT-U6.1，构建成siTNF-α真核表达载体。转染人肺腺癌A549细胞后，以未转染组、转染pRNAT-U6.1-siCon组和转染pRNATU6.1组作为对照，排除了质粒载体本身的干扰因素。Real Time PCR和Western blot结果均显示，转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的 A549细胞与其余3组细胞比较，TNF-α和 TGF-β1 mRNA及蛋白表达均降低;而其余3组间差异无统计学意义。靶向TNF-α的siRNA真核表达载体构建成功，该载体在沉默TNF-α基因表达的同时，还可降低TGF-β1基因的表达。该研究结果下一步利用RNAi技术干预肺间质纤维化大鼠模型的研究和肺纤维化的基因靶向治疗奠定了细胞水平上的基础。

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