SDF-1/CXCR4的表达与喉癌组织VEGF-C表达、淋巴管生成及预后的相关性

王 莹 李文媛 梁金花 丁 利 赵斯达

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占耳鼻咽喉科恶性肿瘤7.9%～15.0%，近年来发生率呈显著增长趋势［1，2］。目前趋化因子受体(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)及其配体趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)相互作用形成的生物轴SDF-1/CXCR4在肿瘤转移中的作用越来越受到人们的关注，研究发现SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌和口腔癌等多种恶性肿瘤的转移中发挥重要作用，能够促进肿瘤的血管生成，已成为肿瘤血管生成治疗的一个新靶点，但关于SDF-1/CXCR4对肿瘤淋巴管生成的作用尚不明确［3］。血管内皮生长因子 -C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是目前最具代表性的淋巴管生成因子，通过激活淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3可促进淋巴管内皮细胞增殖分化并诱导淋巴管生成。为此，本研究探讨了SDF-1/CXCR4的表达与喉癌中VEGF-C表达、淋巴管生成和预后的关系，为喉癌的诊治研究提供新的思路。

材料与方法

1.临床资料:选取中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科2004年1月～2009年3月首次经手术治疗的原发喉癌患者45例。女性43例，男性2例，平均年龄63.5岁。喉癌位于声门上者17例，声门者23例，声门下者5例。按国际抗癌协会(UICC)1997年 TNM分期标准，T1N0M0 6例，T2N0M0 6例，T2N1M0 2例，T3N0M0 14例，T3N1M0 9例，T4N0M0 4例，T4N1M0 3例，T4N2M0 1例。有颈淋巴结转移15例，淋巴管浸润8例。随访至2009年6月1日，随访时间为3～71个月，平均31个月。死亡10例，其中呼吸困难2例，远处转移4例，其他疾病3例，原因不明1例。对照组20例，均为声带息肉手术切除病例。

2.主要试剂:二甲胂酸钠，腺苷-5'-磷酸钠，萘酚ASMX磷酸钠，左旋咪唑，固蓝BB盐，二甲基甲酰胺(DMF)均购自美国SIGMA公司。SDF-1、CXCR4、VEGF-C抗体及 SP试剂盒均购自北京中杉公司技术有限公司。Trizol试剂、SuperscriptⅡ反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA标志物购自 Takara公司，SDF-1、CXCR4、VEGF-C和β-actin引物由大连宝生物合成。

3.免疫组织化学染色:严格按照免疫组化试剂盒说明的步骤进行，其中一抗浓度 SDF-1(1∶100)、CXCR4(1∶150)、VEGF-C(1:100)。以PBS代替一抗做阴性对照。评分标准按照细胞着色强度(无，0分;弱，1分;中，2分;强，3分)和切片中阳性细胞率评分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;＞50%，4分)之和为该病例评分值，将评分值≤2分定为阴性，≥3分定为阳性。

4.酶组化染色方法:采用王莹等［4］报道方法进行酶组化染色方法(5'-Nase法)。淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LVD)定量分析:先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野淋巴管数，取其均值作为该切片淋巴管数。

5.统计学方法:应用SPSS 11.5统计软件进行处理。计数资料采用χ2检验，相关分析采用Spearman检验，两组间LVD比较采用t检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C的表达情况:SDF-1、CXCR4和VEGF-C阳性表达位于细胞质和胞膜内，呈棕黄色颗粒状(图1～图3)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C在喉癌组织中的阳性表达率分别为53.3%、35.5%和37.7%，在对照组中的阳性表达率分别为15%、10%和15%，均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.SDF-1、CXCR4和VEGF-C与临床病理特征的关系及相关性分析:在各种临床因素中，SDF-1和CXCR4蛋白表达均与TNM分期、淋巴结转移、淋巴管浸润密切相关(P＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤分化程度无相关性(P＞0.05)。VEGF-C蛋白表达与淋巴结转移及淋巴管浸润密切相关(P＜0.05)，但与年龄、性别、肿瘤部位、TNM 分期及肿瘤分化程度无相关性(P＞0.05)(表1)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C三者蛋白表达呈正相关(P＜0.05)(表2)。

3.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C与 LVD的关系:5'-Nase特异性地表达在喉癌组织中毛细淋巴管内皮细胞，在光镜下可见呈棕黄色的点状(横切面)或条状(纵切面，图 4)，SDF-1、CXCR4和VEGF-C表达均与瘤内和瘤周LVD密切相关(P＜0.05，表 3)。

4.生存率分析:按SDF-1、CXCR4表达的不同将喉癌患者分为两组，［(-)为阴性，(+)为阳性］，Kaplan-Meier生存分析绘出喉癌患者整体生存曲线，CXCR4阳性表达平均生存时间为(52.8±6.1)个月，阴性表达组平均生存时间为(55.1±4.3)个月，Log rank检验表明CXCR4阳性表达与生存率不相关(χ2=0.284，P=0.498)。SDF-1 阳性表达平均生存时间为(28.5±4.8)个月，阴性表达组平均生存时间为(62.8±3.7)个月，Log rank检验表明SDF-1阳性表达生存率显著低于阴性表达(χ2=11.175，P=0.001)(图5)。

表1 SDF-1、CXCR4和VEGF-C表达与喉癌临床病理学特征的关系

表2 喉癌组织中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表达的关系

表3 喉癌组织中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表达与LVD表达的关系

图5 喉癌患者整体生存曲线

讨 论

SDF-1是骨髓基质细胞和成骨细胞所产生的CXC类趋化蛋白，CXCR4是目前已知SDF-1唯一的受体，近年来研究发现SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌和口腔癌中均能诱导高表达，其高表达与肿瘤细胞存活率和局部淋巴结转移的增强及患者生存率降低有关［3］。本研究结果显示SDF-1和CXCR4的蛋白在喉癌组织中表达显著高于对照组，两者表达均与TNM病理分期、淋巴结转移、淋巴管浸润密切相关。以上结果提示SDF-1/CXCR4生物轴能够促进喉癌的发生发展及淋巴结转移。Stephan Paget提出了“种子-泥土”假说，指出器官内在的特异性性状与肿瘤的选择性转移有关［5］。因此我们推测，CXCR4阳性喉癌细胞(种子)可以有效地诱导SDF-1高表达的肿瘤微环境，进而诱导喉癌细胞淋巴管浸润(泥土)，促进喉癌细胞的转移。

最近有报道表明，SDF-1与CXCR4结合能够上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，诱导肿瘤血管生成［6］。但SDF-1/CXCR4轴是否促进肿瘤淋巴管生成尚不清楚。许多研究报道已证实VEGF-C是目前最具代表性的淋巴管生成因子，其表达与多种人类肿瘤淋巴管转移关系密切。本实验发现，SDF-1/CXCR4与VEGF-C在喉癌组织中有过度表达，又都与淋巴管密度、淋巴结转移和淋巴管浸润等生物学特性相关，而且SDF-1/CXCR4与VEGF-C表达之间显著正相关。由此推测SDF-1/CXCR4能够通过诱导VEGF-C表达上调，促进喉癌淋巴管生成和淋巴管转移，但其具体作用机制有待于进一步研究。

目前关于SDF-1和CXCR4表达对肿瘤预后影响的相关报道尚不多见，且争议较多。Liu等［3］研究发现乳腺癌中CXCR4阳性表达与生存率相关，但Clatot等［7］研究发现SDF-1与头颈部鳞状细胞癌生存率密切相关，而CXCR4与生存率不相关。本实验结果表明CXCR4阳性表达与生存曲线不相关，但SDF-1阳性表达生存率显著低于阴性表达，与Clatot等观察结果相一致。因此，检测喉癌患者SDF-1蛋白表达将有望成为判断喉癌预后的一个新指标。

1 常玮，王斌全.RECK和MMP-9在喉鳞癌中的表达及其临床意义［J］. 医学研究杂志，2010，39(4):73-76

2 王莹，李文媛，孙平，等.ET-1和VEGF-D的表达与喉癌组织淋巴管生成及预后关系［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2011，18(11):575-579

3 Liu F，Lang R，Wei J，et al.Increased expression of SDF-1/CXCR4 is associated with lymph nodemetastasis of invasive micropapillary carcinoma of the breast［J］.Histopathology，2009，54(6):741-750

4 王莹，李文媛，富泽龙，等.喉淋巴管的几种组织化学显色法比较观察［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2008，17(1):70-73

5 Hirakawa S，Detmar M，Kerjaschki D，et al.Nodal lymphangiogenesis and metastasis:role of tumor-induced lymphatic vessel activation in extramammary Paget's disease［J］.Am J Pathol，2009，175(5):2235-2248

6 Shen X，Wang S，Wang H，et al.The role of SDF-1/CXCR4 axis in ovarian cancer metastasis［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(3):363-367

7 Clatot F，Picquenot JM，Choussy J，et al.Intratumoural level of SDF-1 correlates with survival in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2011，47(11):1062-1068