诱导11β-HSD1表达对GC保护血管内皮炎性损伤作用的影响

王兴友 王丽娜 陈晓琳 陈杭薇

根据我们前期研究，初步表明糖皮质激素(GC)能有效保护脂多糖(LPS)诱导的血管内皮炎性损伤［1］。鉴于11β-HSD是目前公认的GC受体前调节的关键物质，其两型同工酶11β-HSD1和11β-HSD2在人脐静脉内皮细胞中均有组成性表达，同时我们前面的实验表明内毒素和糖皮质激素对11β-HSD的表达均有影响［2］。因此通过干预人脐静脉内皮细胞内的11β-HSD表达，必定会对细胞炎症反应有所影响。甘草次酸(glycyrrhizic acid，GA)作为11β-HSD的传统抑制剂，在其他组织细胞对11β-HSD表达影响的研究已有很多报道，有研究表明应用甘草次酸类药物，可抑制嗜酸细胞阳离子蛋白与气道上皮细胞的结合从而减轻气道炎症［3］。但目前有关其对血管内皮细胞11β-HSD影响的研究尚未见报道，鉴于11β-HSD1可增强细胞内GC的活性，而11β-HSD2则降低细胞内GC的活性。因此我们推测，甘草次酸的抗炎作用既与抑制11β-HSD2表达有关，也与增强11β-HSD1表达有关。我们已初步证实甘草次酸对血管内皮细胞11β-HSD2表达的抑制可增强GC的抗炎作用(将另文发表)，本实验拟观察甘草次酸(GA)能否诱导人脐静脉内皮细胞11β-HSD1表达，从而增强GC的抗炎作用。

材料与方法

1.实验材料:(1)主要仪器:PCR扩增仪，Lambda Bio20紫外分光光度计，AlphaImagerTM2200型凝胶成像仪，台式冷冻离心机，Power AC电泳仪，金属浴。(2)主要试剂:总RNA提取试剂盒，AMV反转录酶，Taq DNA聚合酶，Oligo(dT)15，dNTP，RNA酶抑制剂，DNA marker，甘草次酸，脂多糖，糖皮质激素，ELISA试剂盒。

2.实验方法:(1)细胞分组及处理:1)GA对单纯血管内皮细胞11β-HSD1表达的影响:为了观察不同浓度GA对11β -HSD1 的基因转录的影响，用 10-8、10-7、10-6、10-5、10-3mol/L的GA分别与血管内皮细胞共培养24h，不接触GA的细胞作对照;2)GA对炎性损伤的血管内皮细胞的效应观察:①LPS致伤组:在培养细胞中加入100ng/ml的LPS“致伤”24h;②GA保护组:先加10-6mol/L GA 2h后，再用100ng/ml的LPS处理细胞24h;③GA-GC复合组:在培养细胞中先后加入10-6mol/L GA和Dex 2h后，再用100ng/ml的LPS处理细胞24h;④GC保护组:不加GA，在培养细胞中先后加入10-6mol/L Dex 2h后，再用100ng/ml的LPS处理细胞24h;⑤单纯GA组:在培养细胞中先后加入10-6mol/L GA后，再继续培养24h;⑥空白对照组:不用GA、LPS和Dex的正常培养细胞作正常对照。上述各组观察时相到后分别搜集细胞和培养上清进行有关指标的检测。(2)HUVEC内11β-HSD1的mRNA表达的检测:11β-HSD1引物由上海博亚生物技术有限公司合成，各基因引物序列见表 1［4，5］。然后按 RT-PCR常规合成相应的PCR产物，将电泳图像保存于计算机用Bandscan软件进行图像分析，计算人脐静脉内皮细胞内11β-HSD1的mRNA与β-actin mRNA的灰度比值。(3)IL-6和sICAM-1的检测:参照文献［1］进行。(4)HUVEC原位细胞凋亡的检测:参照文献［1］进行。

表1 PCR引物的序列及其产物长度

3.统计学方法:使用SPSS 11.0软件包进行，全部数据都以均数±标准差(±s)表示，组间差异用方差分析，组内差异比较采用t检验。结果百分率采用χ2检验进行分析，用二变量(Bivariate)Pearson相关系数进行相关分析。以P＜0.05为差异显著，P＜0.01表示差异具有非常显著性意义。

结 果

1.GA对HUVEC11β-HSD1的mRNA表达的影响:(1)GA对血管内皮细胞11β-HSD1 mRNA的影响:在正常培养的细胞可检测到较少量的11β-HSD1 mRNA，甘草次酸在一定剂量范围(10-8～10-3mol/L)与细胞血管内皮共培养24h，可引起11β-HSD1 mRNA明显增加，并随着剂量的增高，逐渐形成平台(表2)。(2)GA对地塞米松和 LPS诱导11β-HSD1 mRNA表达的影响:GA本身能明显诱导11β-HSD1 mRNA的表达，GA对Dex诱导的11β-HSD1 mRNA表达有促进作用，而对 LPS诱导的11β-HSD1 mRNA表达则没有促进作用，详见表3。

表2 GA对血管内皮细胞11β-HSD1 mRNA的影响(±s)

表2 GA对血管内皮细胞11β-HSD1 mRNA的影响(±s)

与对照组相比，*P＜0.05;与低剂量组相比，△P＜0.05;与大剂量、超高剂量组相比，#P＜0.05

组别 GA浓度(mol/L)11β-HSD1 mRNA/β-actin mRNA对照组00.03±0.004低剂量组 10-8 0.04±0.005常规剂量组 10-7 0.08±0.002*大剂量组 10-6 0.16±0.02＊△高剂量组 10-5 0.26±0.04＊△#超高剂量组 10-3 0.31±0.07＊△

表3 大剂量GA(浓度为10-6mol/L)对HUVEC的11β-HSD1 mRNA表达的影响(±s)

表3 大剂量GA(浓度为10-6mol/L)对HUVEC的11β-HSD1 mRNA表达的影响(±s)

与单纯GA组比，*P＜0.05;与GC保护组比，△P＜0.05;与空白对照组比，#P＜0.01;与GA保护组及LPS致伤组比，▲P＞0.05

组别 11β -HSD1 mRNA/β-actin mRNA空白对照组0.03±0.004 LPS致伤组 0.38±0.06 GA保护组 0.41±0.07*GA-GC复合组 0.42±0.09＊△▲GC保护组 0.28±0.03单纯GA组 0.16±0.02#

2.GA对HUVEC分泌IL-6和sICAM-1的影响:在LPS的刺激下，HUVEC分泌IL-6和sICAM-1的量明显增多。而GA和Dex均能抑制二者的分泌，GA与Dex合用可显著抑制IL-6和sICAM-1的分泌。具体见表4。

表4 大剂量GA(浓度为10-6mol/L)对HUVEC的IL-6和sICAM-1分泌的影响(± s，pg/ml)

表4 大剂量GA(浓度为10-6mol/L)对HUVEC的IL-6和sICAM-1分泌的影响(± s，pg/ml)

与致伤组比，*P＜0.05，△P＜0.01

组别 IL-6含量 sICAM-1含量空白对照组63.2±6.3 23.2±2.7 LPS致伤组 606.1±17.3 516.8±15.1 GA保护组 436.2±11.8* 383.2±6.3*GA-GC复合组 168.6±21.9△ 26.3±2.9 GC保护组 66.3±5.1 216.5±12.2△单纯GA组 286.5±11.3△ 156.3±11.3△

3.GA对HUVEC发生原位凋亡的影响:GA和Dex均能明显抑制LPS诱导的血管内皮细胞凋亡，二者合用表观上增加了对HUVEC凋亡的抑制效应，但统计学上与单独应用Dex的作用并无差异，具体见表5。

表5 大剂量GA(浓度为10-6mol/L)对HUVEC的发生凋亡的影响( ± s，%)

与LPS致伤组比，*P＜0.01，△P＜0.05;与GA保护组比，#P＜0.05;与GC保护组比，▲P＞0.05

组别 细胞凋亡率空白对照组1.2±0.4 LPS致伤组 36.7±3.9 GA保护组 23.5±1.7△GA-GC复合组 12.6±0.6＊▲#GC保护组 13.2±0.9*单纯GA组1.6±0.3

讨 论

甘草次酸具有抗炎、抗过敏、镇咳、平喘及祛痰等广泛的药理作用，其中抗炎、抗过敏、平喘的作用与糖皮质激素相似。但至今GA与GC的内在关系缺乏深入研究，探讨二者的关系将有助于进一步揭示和深化GC的抗炎作用机制，为临床合理应用GC提供新的思路。以往研究中，甘草次酸已被视为经典的11β-羟基类固醇脱氢酶的抑制剂。有关GA与11β-羟基类固醇脱氢酶的研究主要涉及其不良反应的产生机制，比如临床应用该药常伴有的假醛固酮增多症(pseudoaldosteronism)就认为与GA对11β-羟基类固醇脱氢酶的抑制有关［6］。但有关GA通过如何调节血管内皮细胞的11β-羟基类固醇脱氢酶，进而参与炎症调控的研究，迄今未见报道。

长期以来认为GA发挥抗炎作用与阿司匹林相似，但与地塞米松不同。GA抗炎机制被认为与抑制脂氧酶和环氧酶，进而抑制 LTC4、LTD4、LTE4及PGE2等炎性介质的生成有关。但近年认为与调节T细胞分泌IL-5等细胞因子有关［7］。在本实验中，我们观察到GA能显著抑制LPS诱导的HUVEC分泌IL-6和sICAM-1，同时显著降低LPS诱导的HUVEC的细胞凋亡率。因此笔者认为抑制IL-6等前炎症细胞因子的产生，减少血管内皮细胞和白细胞的黏附，保护血管内皮细胞的损伤也是GA的一个抗炎机制。鉴于11β-HSD是GC作用的受体前调节的关键物质，GA又是传统的11β-HSD抑制剂，但在本实验中，我们观察到GA并没有对11β-HSD1的表达进行抑制，相反却能诱导11β-HSD1的表达，故我们推测GA主要对11β-HSD2表达起抑制作用，而对11β-HSD1则主要起诱导作用，也许GA对11β-HSD的这种双向作用，正是其发挥抗炎作用的根本途径。因此11β-HSD1完全可以作为GA抗炎等作用的一个靶点。GA与GC合用所增强的抗炎效应与11β-HSD的表达情况必定会有联系。

近年来抑制11β-HSD1的研究主要是关于代谢疾病，例如肥胖和糖尿病［8］。本研究发现，GA单独作用于人脐静脉内皮细胞时，能够上调 11β-HSD1mRNA的表达。GA与GC(Dex)合用也可促进11β-HSD1mRNA的表达。同时加强了GC对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及炎性细胞因子IL-6、sICAM-1分泌的抑制作用，对GA对炎症的影响有一定意义。

1 王兴友，陈杭薇，钱桂生.糖皮质激素对血管内皮炎性损伤的保护机制［J］. 解放军医学杂志，2007，32(5):508-512

2 Liu Y，Mladinov D，Pietrusz JL，et al.Glucocorticoid response elements and 11b-hydroxysteroid dehydrogenases in the regulation of endothelial nitric oxide synthase expression［J］.Cardiovasc Res，2009，81(1):140-147

3 Hao-Teng，Louis JT，Ta-Jen H，et al.Inhibition of the interactions between eosinophil cationic protein and airway epithelial cells by traditional［J］.Chinese herbs，2010，4(Suppl 2):S8-S18

4 Liu Y，Park F，Pietrusz JL，et al.Suppression of 11fbetag-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 with RNA interference substantially attenuates 3T3-L1 adipogenesis［J］.Physiol Genomics，2008，32(3):343-351

5 Tian Z，Greene AS，Usa K，et al.Renal regional proteomes in young Dahl salt-sensitive rats［J］.Hypertension，2008，51(4):899-904

6 Kageyama K，Takayasu S，Moriyama T，et al.A case of pseudoaldosteronism，accompanied with hypocalcemia and exaggerated ACTH response［J］.Endocr J，2004，51(1):83-87

7 Xiu-Min L，Laverne B.Efficacy and mechanisms of action of traditional Chinese medicines for treating asthma and allergy［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，123(2):297-308

8 Stanetty C，Czollner L，Koller I，et al.Synthesis of novel 3-amino and 29-hydroxamic acid derivatives of glycyrrhetinic acid as selective 11β -hydroxysteroid dehydrogenase 2 inhibitors［J］.Bioorg Med Chem，2010，18(21):7522-7541