RNAi介导的SOCS3基因沉默对高脂肥胖大鼠瘦素抵抗的影响

张 旭 刘正娟 翟 娜 吴 鸣 滕懿群 陈俊国 骆秋龙 陆 燕

肥胖症是糖尿病、高血压、冠心病等疾病的主要危险因素，严重威胁人类健康。瘦素抵抗是肥胖症发病的机制之一［1］。SOCS3(suppressors of cytokine signaling 3)基因的过度表达可导致瘦素抵抗，在肥胖症的发病过程中起重要作用［2～4］。本实验观察抑制SOCS3基因表达对高脂肥胖大鼠瘦素抵抗的影响。

材料与方法

1.主要材料:LV-shSOCS3，LV-negtive，病毒效价为1.0×1010TU/L，由本课题组前期构建。SD大鼠60只健康，雄性，5周龄体重100～130g，由大连医科大学实验动物中心提供。ABI7500全自动荧光定量PCR仪(美国ABI公司);大鼠中枢立体定位仪(成都泰盟科技有限公司);Trizol试剂(Invitrogen公司)。瘦素放射免疫试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心)。

2.方法:(1)实验动物分组:选用5周龄的健康雄性SD大鼠60只，体重100～130g，随机分为3组，每组20只:①实验组:下丘脑注射LV-shSOCS3，高脂饲料喂养;②阴性组:下丘脑注射LV-negtive，高脂饲料喂养;③对照组:下丘脑注射生理盐水，高脂饲料喂养。(2)动物模型的制作:大鼠禁食12h后用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔内注射麻醉，固定于中枢立体定位仪上。头部去除毛发，消毒，沿中线做1.5cm的切口，暴露颅骨，刮净骨膜，显露前囟，按照SD大鼠脑立体定位图谱，于前囟后2.8mm，矢状缝右侧0.4mm处用骨钻钻一直径约1mm的骨孔，以小号针头刺破硬脑膜，5μl微量注射器针头垂直插入颅骨表面下9.5mm(下丘脑弓状核处)注射2μl LV-shSOCS3(或 LV-negtive或生理盐水)，速度0.4μl/min，注射完毕后休息5min，以1mm/min的速度退针。手术后缝合伤口，局部抗感染。所有动物均两只一笼喂养，予以高脂饲料(脂肪66%，糖类25%，蛋白质9%)，共喂养8周，期间自由饮水，不限饲料量，每周称重1次。其间有部分大鼠因打药不慎死亡，数据剔除。(3)标本收集与保存:大鼠喂养8周末，自由饮水，禁食12h后用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔内注射，麻醉成功后开胸心脏取血约5ml，3000r/min离心10min，分离血清待检，同时迅速取出下丘脑，取一小块行冷冻切片，在荧光显微镜下观察注射位置是否在下丘脑，其余部分置于液氮中保存。(4)血脂和瘦素检测:血标本全部采集后，采用酶显色法检测血脂(血总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)浓度。利用放射免疫法检测血清瘦素水平。(5)荧光实时定量PCR检测下丘脑内瘦素受体(OBRb)﹑SOCS3mRNA表达水平的测定:用Trizol提取下丘脑组织总RNA。以等量RNA为起始模板，反转录合成 cDNA。SOCS3上、下游引物:5'-ACCAGCGCCACTTCT TCACG-3'，5'-GTGGAGCATCATACTGATCC-3'，OB-Rb 上、下游引物:5'-AGAATTGTTCCTGGGCACAAG-3'，5'-ACACTCATCCTCACAGGTTCC-3'，内参 β-actin上、下游引物5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'，5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。在ABI7500全自动荧光定量PCR仪上进行PCR，反应条件 SOCS3为 95℃ 预变性 5min;95℃ 10s;57℃ 15s，72℃20s，共35个循环。OB-Rb为94℃预变性3min;94℃ 30s;57℃ 30s;72℃ 30s，共35个循环。

结 果

1.下丘脑注射慢病毒结果:高脂喂养8周后，剔除因下丘脑注射不慎死亡的大鼠，成模大鼠45只。荧光显微镜下观察到所有被注射LV-shSOCS3和LV-negtive大鼠的下丘脑均有绿色荧光蛋白表达，说明注射位置正确;注射生理盐水的大鼠下丘脑未见有荧光蛋白表达。

2.经RNA干扰后大鼠体重的变化:注射前，各组大鼠体重无明显差异。注射后予以高脂饲料喂养，实验组体重增长低于其他两组，喂养8周末，实验组平均体重明显低于其他两组(P＜0.05)，而阴性组和对照组之间无明显差异(P＞0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠体重比较( ± s，n=15)

表1 各组大鼠体重比较( ± s，n=15)

与对照组比较，aP ＜0.05，cP ＞0.05，dP＞0.05;与阴性组比较，bP ＜0.05，eP＞0.05

组别 0周 2周 4周 6周 8周对照组 111.33±9.50 224.46±18.92 323.93±22.97 400.60±23.99 450.87±23.83阴性组 112.93±9.87c 221.80±22.06c 316.07±22.60c 395.67±21.98c 443.80±15.79实验组 109.33±10.70de 186.66±22.59ab 251.27±25.94ab 295.60±27.09ab 337.40±28.83ab

3.血清瘦素、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的变化:实验组瘦素，TG、TC、LDL-C 均明显低于其他两组(P＜0.05)，对照组和阴性组之间无明显差异(P＞0.05);实验组HDL-C明显高于其他两组(P＜0.05)，对照组和阴性组之间无显著差异(P ＞0.05)，详见表2。

表2 各组大鼠瘦素和血脂的比较( ± s，n=15)

表2 各组大鼠瘦素和血脂的比较( ± s，n=15)

与对照组比较，aP＜0.05，cP＞0.05;与阴性组比较，bP＜0.05

组别 瘦素(ng/ml) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)对照组 1.22±0.30 0.64±0.17 1.39±0.25 1.27±0.16 0.77±0.12阴性组 1.11±0.13c 0.65±0.27c 1.42±0.28c 1.29±0.19c 0.75±0.16c实验组 0.63±0.11ab 0.38±0.16ab 1.14±0.31ab 1.77±0.26ab 0.57±0.09ab

4.大鼠下丘脑SOCS3、OB-Rb基因表达的变化:实验组SOCS3 mRNA明显低于其他两组(P＜0.05)，对照组和阴性组之间无显著差异(P＞0.05);实验组OB-Rb mRNA明显高于其他两组 (P＜0.05)，对照组和阴性组之间无显著差异(P＞0.05)，详见表3。

表3 各组大鼠下丘脑SOCS3、OB-Rb基因表达的比较( ± s，n=15)

表3 各组大鼠下丘脑SOCS3、OB-Rb基因表达的比较( ± s，n=15)

与对照组比较，aP＜0.05，cP＞0.05;与阴性组比较，bP＜0.05

组别SOCS3 mRNA OB-Rb mRNA对照组1.43±0.30 0.51±0.20阴性组 1.35±0.25c 0.59±0.27c实验组 0.34±0.19ab 1.34±0.39ab

讨 论

肥胖症是由于长期能量摄入超过人体消耗，使体内脂肪增多，体重超过一定范围的一种营养障碍性疾病。随着肥胖发生率逐年递增，由肥胖所带来的种种并发症如糖尿病、心脑血管疾病等严重危害人类的健康。瘦素是肥胖基因表达产物，具有抑制食欲，减少食物摄入，增加能量消耗的作用，使机体不至于过度肥胖［5，6］。研究表明肥胖者血清瘦素并不降低反而表现为高瘦素血症，提示肥胖者存在瘦素抵抗。多种原因均可引起瘦素抵抗，而向饮食诱导的肥胖大鼠中枢注射瘦素并无疗效，说明瘦素抵抗发生在受体及受体后转导水平［7］。肥胖者OB-Rb的mRNA表达下调参与瘦素抵抗的发生机制［8］。SOCS3是由细胞因子和一些激素诱导的SOCS蛋白质家族的一个成员，它主要通过抑制细胞因子或激素与其受体结合后胞内信号转导通路，进而减弱细胞因子或激素的生理作用［9］。动物实验表明高脂诱导的肥胖鼠下丘脑和白色脂肪组织中SOCS3基因表达明显增加并参与瘦素抵抗的发生，进而参与了多种疾病的形成过程，因此可以推测通过下调体内SOCS3基因的表达来减弱其抑制相关信号转导的作用，在疾病治疗中具有一定的应用前景。RNA干扰技术作为新兴的基因沉默技术具有明显优势，它比反义核酸技术有效，比基因敲除技术简单，具有基因沉默高度特异性及高效性的优点。目前，RNA干扰技术已基本成熟，已被广泛应用于许多疾病的治疗研究中［10，11］。

本研究将SOCS3 RNAi慢病毒液注射到大鼠下丘脑后，实验组下丘脑的SOCS3mRNA表达水平明显下降。在高脂喂养8周后，该组大鼠体重、血清瘦素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇较其他两组下降明显，而高密度脂蛋白胆固醇则升高，同时该组大鼠下丘脑OB-Rb的mRNA水平明显高于其他两组，提示下调SOCS3基因后可缓解大鼠的高脂性肥胖及瘦素抵抗的程度。大鼠下丘脑注射慢病毒干扰液后，慢病毒载体进入下丘脑神经细胞，能将携带的目的基因整合到细胞基因组中，实现RNA干扰，此时予以大鼠高脂喂养8周，由于慢病毒介导的RNA干扰可长期、稳定、高效地下调目的基因，那么高脂喂养大鼠本该上调的SOCS3基因可被长期沉默。通过RNAi下调SOCS3基因后，SOCS3抑制瘦素与OBRb结合后信号转导通路的作用减弱，使瘦素能正常的发挥其降脂作用，使高脂喂养的大鼠脂肪含量减少，体重下降。大鼠体重的下降，一方面，抑制脂肪刺激瘦素的分泌;另一方面，促进OB-Rb基因的表达;进而改善了肥胖大鼠的瘦素抵抗。

本研究在动物模型水平证实了抑制下丘脑SOCS3基因对肥胖大鼠瘦素抵抗和肥胖程度的改善作用，为进一步研究人类瘦素抵抗和肥胖症的发生机制提供了极为有利的工具。

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5 Bjornholm M，Munzberg H，Leshan RL，et al.Mice lacking inhibitory leptin receptor signals are lean with normal endocrine function［J］.J Clin Invest，2007，117(5):1354-1360

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