羊肚菌（Ydj0705）液体发酵工艺方法的研究

张旺璧，薛 莉

（山西省医药与生命科学研究院，太原030006）

羊肚菌（Morchella conica）是一种食用药用价值很高的大型真菌，羊肚菌（Morchella.denta L.）又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，按Ainsworth分类系统隶属于子囊菌亚门（Aseomycotina）、盘菌（Diseomyeetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（Morchella）［1］。羊肚菌具有极高的营养价值和药用价值，是一种大型的食用兼药用真菌。羊肚菌是著名的野生食用菌，它不仅营养丰富、味道鲜美，而又是主治消化不良、痰多气短的良好中药［2］。

长期以来，由于羊肚菌野生资源匮乏，满足不了市场需求，因此许多食用菌工作者对其进行人工栽培方面的研究。可是，由于羊肚菌子实体对其繁衍条件和生长环境的要求十分苛刻，导致规模化人工栽培方面的研究尚无实质性突破。至今，国内关于此类研究报道很多，但是，羊肚菌仍不能像香菇、杏鲍菇、白灵菇等菌类产品那样成功实现规模化生产，进入市场［3］

羊肚菌菌丝体不仅含有子实体的各种营养成分，还具有子实体独特的风味，而且液体发酵可以进行工业化的连续生产，具有规模大、菌丝体产量高、发酵周期短、生产效益高等优点［4］。笔者通过正交试验，确定羊肚菌的最优液体培养基配方和最佳发酵工艺条件，最终达到菌丝发酵生产的小试生产规模，以求对系统开发菌类产品、提高菌类产品的价值产生深远的意义。

羊肚菌Ydj0705菌种分离、液体发酵工艺研究，其目的是应用液体培养菌丝发酵技术，完成羊肚菌的菌种分离与培养、生物学特性研究、培养基筛选及培养工艺条件的确定。通过羊肚菌Ydj0705菌丝的多糖含量测试及S180抑瘤试验证明，该菌丝多糖含量与国内相关报道的发酵工艺所得的菌丝多糖含量相比，含量要高；同时其小鼠S180试验抑瘤率为80%。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

羊肚菌Ydj0705菌种子实体于2007年5月初采自山西关帝山。该地气候特点是四季分明，气候温和，属温带大陆性气候。从海拔1 300～2 830m的主峰，气候差异较大，气候垂直变化明显。年平均气温约－4～22℃。夏季峰顶平均气温在16.5℃。植物以寒温性针叶林为中心区，温性针叶林为外围，山地落叶阔叶林为过渡带的整体格局，羊肚菌就生长于山地落叶阔叶林过渡带中。羊肚菌分离、纯化过程如图1所示。

图1 羊肚菌分离、纯化过程

1.1.2 培养基

1）斜面培养基（PDA）。马铃薯去皮鲜重200 g，葡萄糖20g，琼脂18g，pH自然。

2）液体发酵基础培养基。萄萄糖30g，蛋白胨10g，KH2PO41.0g，MgSO40.75g，pH 为6.0.

1.1.3 主要药品与仪器设备

琼脂购自山西太原双鹤药业有限公司；玉米粉、黄豆粉购于山西省农科院，用前过60目筛；葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、尿素等购于国药集团上海化学试剂有限公司。主要仪器设备为LDZX－40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-ICU双人单面净化工作台、HYG-B全温度摇瓶柜。

1.2 实验方法

1.2.1 液体种子培养液制备

将4℃保藏的羊肚菌菌种转接至新鲜的PDA斜面培养基，置28℃中培养，菌丝基本长满斜面备用。在无菌条件下，从PDA斜面上挑取1cm2划碎后的羊肚菌Ydj0705的菌丝体，接入到装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，置28℃恒温摇床振荡培养，转速150r／min，培养7d得一级种子培养液。按10%的接种量，将一级种子液接入到装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，置于28℃的摇床上振荡培训7d得二级种子液，备用。

1.2.2 菌丝体生物量的测定方法

定量取发酵液，3 000r／min离心10min，弃上清液，所得菌丝体用蒸馏水洗再离心，反复洗涤离心三次后，置于60℃干燥箱中烘干，并称重［5］。计算出每毫升发酵液中的菌丝体生物量（mg／mL）。

1.2.3 培养基配方优化

1）碳源筛选试验。将液体发酵基础培养基中的碳源葡萄糖分别用等量玉米粉（玉米粉需煮沸取汁）、可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米粉＋葡萄糖、可溶性淀粉＋葡萄糖、玉米粉＋蔗糖替换，培养条件与种子培养条件相同，每组设三个重复，考察不同碳源及其组合对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

2）氮源筛选试验。将液体发酵基础培养基中的氮源蛋白胨分别用黄豆粉（24g／L，黄豆粉需煮沸取汁）、酵母粉（28g／L）、硝酸铵（3g／L）、硫酸铵（8 g／L）、黄豆粉（12g／L）＋酵母粉（14g／L）、酵母粉（14g／L）＋蛋白胨（5g／L）替换，培养条件与种子培养条件相同，每组设三个重复，考察不同碳源对羊肚菌菌丝体生物量的影响。各氮源在每升培养基中添加量根据各自的全氮含量相对于10g蛋白胨全氮含量折算［6］。

3）培养基配方优化试验。根据以上试验结果，对玉米粉、葡萄糖、黄豆粉、蛋白胨以及无机盐KH2PO4和MgSO4进行正交试验，确定最适发酵培养基配方，选用正交表L18（37）［3］，以菌丝体生物量为考察指标，设计正交试验，各处理均设3个重复，如表1所示。

表1 培养基配方正交优化试验设计表 g／L

1.2.4 液体发酵培养条件的优化

在确定最佳发酵培养基成分的基础上，设定不同温度、pH、装液量、接种量和转速进行单因素试验。根据单因素试验结果，设定培养温度26℃，转速150r／min；以培养基初始pH、装液量和接种量为主要影响因素，选定不同水平；以菌丝体生物量为考察指标，选用正交表L9（34）进行试验，优化最佳发酵条件。

表2 液体培养条件正交优化试验设计表

1.2.5 羊肚菌Ydj0705液体培养菌丝体生物量变化

按照筛选出的培养基配方及发酵条件，进行羊肚菌液体发酵，每隔12h取样一次，考察菌丝体生物量的变化情况。

2 培养基配方优化试验结果

2.1 羊肚菌Ydj0705的最优碳源筛选结果

不同碳源对羊肚菌液体培养菌丝体生物量的影响见图2所示。试验结果表明，羊肚菌在6种常用碳源中均可生长，但不同碳源对菌丝体生物量的差异较大。其中，玉米粉＋葡萄糖作为碳源时菌丝体生物量较高，以玉米粉和葡萄糖作为复合碳源时菌丝体生物量最高。因此，选用玉米粉和葡萄糖作为羊肚菌液体发酵的最佳碳源。

图2 羊肚菌Yd0705最佳碳源筛选结果

2.2 羊肚菌Ydj0705的最优氮源筛选结果

氮源是构成真菌菌体蛋白质、核酸的重要基础物质，可分为有机氮和无机氮两类。不同氮源对羊肚菌液体培养菌丝浓度影响见图3所示。试验结果表明，羊肚菌能较好地利用有机氮源，而对无机氮的利用较差。其中，黄豆粉加酵母粉作为羊肚菌氮源时菌丝体生物量较高，因此，试验选用黄豆粉加酵母粉作为羊肚菌氮源。

图3 羊肚菌Yd0705最佳氮源筛选结果

2.3 培养基配方正交优化试验结果

选取 A（玉米粉）、B（葡萄糖）、C（黄豆粉）、D（酵母粉D）、E（KH2PO4）和F（MgSO4）作为正交试验因素，正交优化试验直观分析结果见表3，方差分析见表4。试验结果表明，以羊肚菌菌丝体生物量为考察指标，6因素对羊肚菌菌丝体液体发酵影响的显著性次序为：玉米粉＞黄豆粉＞MgSO4＞酵母粉＞KH2PO4＞葡萄糖，即玉米粉对羊肚菌菌丝体生物量影响最为显著，其次是黄豆粉。羊肚菌液体发酵培养基最佳配比为A2B2C3D2E3F2，即玉米粉30g／L，葡萄糖10g／L，黄豆粉20g／L，酵母粉5 g／L，KH2PO4和MgSO4适量，羊肚菌菌丝体生物量可达11.69mg／mL。

表3 培养基配方正交优化试验结果

表4 培养基配方正交优化试验方差分析

2.4 羊肚菌Ydj0705液体培养条件优化结果

设定温度为26℃，转速150r／min条件下，以培养基初始pH、装液量和接种量为主要影响因素，选取不同水平进行正交试验。培养条件正交优化试验结果见表5所示。试验结果表明，以羊肚菌菌丝体生物量为考察指标，三因素对羊肚菌菌丝体液体发酵影响的显著性次序为：初始pH＞接种量＞装液量，即初始pH对羊肚菌菌丝体生物量影响最为显著，其次是接种量。

表5 培养条件正交优化试验结果

2.5 羊肚菌Ydj0705液体培养菌丝体生物量变化结果

真菌菌丝体生物量是真菌液体发酵的重要参考指标［7］，羊肚菌Ydj0705液体培养菌丝体生物量变化结果见图4所示。由图可知，0～48h为延滞期，羊肚菌生长缓慢；48～120h为对数期，羊肚菌菌丝球快速增长，并在120h时达到高峰，菌丝体生物量可达到13.645mg／mL；120h以后进入稳定期和衰亡期，在衰亡期羊肚菌菌丝体开始自溶，菌丝体生物量开始下降。

3 讨论与结论

图4 羊肚菌Ydj0705液体培养菌丝体生物量变化

通过课题组成员采集、分离、培养，得到一种新菌株Ydj0705。对Ydj0705进行了液体发酵培养、培养基考察及培养条件考察，筛选出一套最佳配方。在羊肚菌Ydj0705液体培养基配方优化方面，主要选取碳、氮源以及一些无机盐为主要因素。碳素是真菌最基础、最重要的营养元素，是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，又是真菌重要的能量来源。在液体发酵过程中，碳源是发酵培养基的基础成分，既是菌丝体细胞结构的重要组成部分，又是菌丝体产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的重要原料［7］。玉米粉、葡萄糖作为复合碳源时，菌丝体生物量较高，这可能由于葡萄糖作为速效碳源有利于缩短发酵延滞期，而玉米粉作为长效碳源，可能含有羊肚菌生长所需的一些微量元素，能够促进羊肚菌生长。氮源是构成真菌菌体蛋白质、核酸的重要基础物质，可分为有机氮和无机氮两类［8］。羊肚菌能较好地利用有机氮，不能利用无机氮源。此外，培养基中若缺乏P、K、Mg等元素时，真菌菌丝体生长发育不良［9］。因此，在培养基中选用了磷酸二氢钾和硫酸镁。

预备试验表明，羊肚菌培养温度在24～28℃，摇床转速140～180r／／min之间时，菌丝体生物量变化不明显，因此选择初始pH、装液量和接种量为主要影响因素。适宜的初始pH不但可以缩短发酵延滞期，也有利于菌丝体快速生长繁殖［10］。接种量的大小决定菌丝体的生长状况，接种量高可缩短延滞期，但会导致菌丝体生长过快，造成营养缺乏或溶氧不足，不利于代谢物积累［11］。装液量的大小决定了培养基中的溶氧量，影响到菌丝体的生长量和代谢物的产生、积累［12］。因此，培养条件的优化对羊肚菌液体发酵至关重要。

羊肚菌液体发酵的最佳培养基为：玉米粉30g／L，葡萄糖10g／L，黄豆粉20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO4和MgSO4适量等；最优液体发酵培养条件为：培养温度26℃，摇床转速定量，培养基初始pH为6.0，装液量为100mL培养液，接种量体积分数为10%，发酵时间6 d。羊肚菌摇瓶液体发酵培养参数为今后开展发酵罐中试试验，探索羊肚菌菌丝体规模化生产的工艺条件 奠定了基础。

［1］ 沙业雄.羊肚菌研究进展［J］.食用菌，1990（2）：6-8.

［2］ 章灵华.药用真菌中生物活性多糖的研究进展阴.中草药，1992，23（2）：95-99.

［3］ 尤正海.羊肚菌的研究及其应用开发前景［J］.中国生化药物杂志，1997，18（3）：160-161.

［4］ 王莹，孙永海，王笑丹，等.粗柄羊肚菌菌丝液体培养条件的优化［J］.食用菌，2007，29（6）：5-8.

［5］ 刘勇，张长铠，李昆峰.金针菇FV008深层发酵工艺的研究川.食品与发酵工业，1998，24（3）：8-12.

［6］ 常慧萍.正交法优化鸡腿菇JM-08深层发酵碳氮源的研究［J］.中国食用菌，2008，27（4）：40-41.

［7］ 杨全，李艳辉，严寒静，等.药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究［J］.广东药学院学报，2004，20（3）：213-216.

［8］ 康源春，张玉亭，袁瑞奇，等.添加尿素对金针菇菌丝生长和产量的影响［J］.中国食用菌，2011，30（6）：40-41.

［9］ 乔均俭，王世英，郝粉霞，等.响应面法优化黑曲霉产果胶酶培养基中无机盐成分的研究［J］.生物数学学报，2010，25（3）：508-514.

［10］ 曹娟云，任桂梅，张雪，等.羊肚菌液体培养菌丝体产量与培养液pH 值的关系［J］.江苏农业科学，2007（4）：176-177.

［11］ 王淑芳，马桂珍，石桐磊，等，接种量和酸碱度对滑菇菌丝生长量的影响［J］.北方园艺，2011（21）：160-162.

［12］ 吴祖峰，杨家荣，朱书伟.不同装液量对金顶侧耳液体摇瓶培养的影响［J］.北方园艺，2007（11）：213-215.