滇杨的增殖及生根培养研究

2012-04-29辛培尧刘岩孙正海等

湖北农业科学 2012年15期

辛培尧刘岩孙正海等

摘要：以滇杨（ＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＤｏｄｅ）组织培养获得的不定芽为原材料进行增殖培养和生根培养，考察培养基中激素浓度对不定芽增殖和试管苗生根的影响。结果表明，ＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．０２ｍｇ／ＬＮＡＡ是适合滇杨不定芽增殖的培养基。１／２ＭＳ培养基中添加０．０２ｍｇ／ＬＮＡＡ有利于试管苗的生根。

关键词：滇杨（ＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＤｏｄｅ）；组织培养；增殖；生根

中图分类号：Ｓ７９２．１１８；Ｓ７２３．１＋３２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3366-03

ＳｔｕｄｙｏｎＭｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄＲｏｏｔｉｎｇＣｕｌｔｕｒｅｏｆＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ

ＸＩＮＰｅｉ－ｙａｏａ，ｂ，ＬＩＵＹａｎｂ，ＳＵＮＺｈｅｎｇ－ｈａｉｂ，ＺＨＯＵＪｕｎａ，ｂ，ＴＡＮＧＪｕｎ－ｒｏｎｇｂ，ＨＥＣｈｅｎｇ－ｚｈｏｎｇａ，ｂ，ＤＵＡＮＡｎ－ａｎａ

（ａ．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦｏｒｅｓｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｓｅｉｎｔｈｅＳｏｕｔｈｗｅｓｔＭｏｕｎｔａｉｎｓｏｆＣｈｉｎａ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｏｉｎ；

ｂ．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ，ＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｉｎｖｉｔｒｏｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｏｏｔｉｎｇｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Dode ａｓｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．０２ｍｇ／ＬＮＡＡｗａｓｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｍｅｄｉｕｍｆｏｒａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ａｎｄ１／２ＭＳ＋０．０２ｍｇ／ＬＮＡＡｗａｓｇｏｏｄｆｏｒｒｏｏｔｉｎｇ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＤｏｄｅ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ｒｏｏｔｉｎｇ

滇杨（ＰｏｐｕｌｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＤｏｄｅ）属杨柳科杨属青杨派树种，又名云南白杨，具有适应性较强、生长较快、成材较早、分布海拔变幅大（１３００～３２００ｍ）、易于繁殖等特点，是中国乃至世界少有的分布于低纬度高海拔地区的宝贵杨树资源，也是中国西南地区特有的一种乡土树种［１］。由于滇杨主要分布在云南、四川及贵州等环境复杂、植物种类繁多的地区，而且人们对其认识程度各异，使得滇杨的种质资源保护、开发与利用等工作一直没能得到足够的重视［２］。随着胡杨派、白杨派、青杨派、黑杨派以及大叶杨派中的多个种或杂种离体培养再生体系的成功建立［３］，使得利用杨树组织培养对其种质进行保存以及创新成为现实。本研究将滇杨嫩茎诱导的不定芽接种在不同的增殖和生根培养基上，探讨滇杨组织培养中较佳的增殖及生根培养方案，可为进一步对滇杨进行种质资源的保存、诱变育种以及转基因育种等研究提供理论指导与技术保障。

１材料与方法

１．１材料

利用已筛选出的分化培养基［４］，以滇杨嫩茎为外植体诱导不定芽，以诱导出的不定芽作为试材。

１．２方法

１．２．１增殖培养以ＭＳ为基本培养基［５］，附加不同浓度的细胞分裂素６－ＢＡ和生长素ＮＡＡ（表１），调ｐＨ至６．０。培养温度（２５±２） ℃、光照１５００～２０００ｌｘ、光照时间１２ｈ／ｄ。每处理接种２０瓶，每瓶接种４个不定芽，重复３次。接种后每隔２ｄ观察和记录不定芽的生长情况。以增殖系数及试管苗生长状况为指标，筛选出滇杨不定芽增殖培养的较优方案。１．２．２生根培养生根培养基以１／２ＭＳ为基本培养基［５］，添加３０ｇ／Ｌ蔗糖和４．５ｇ／Ｌ琼脂，再加入不同浓度的ＮＡＡ（０、０．０１、０．０２、０．０５ｍｇ／Ｌ），调ｐＨ至６．０。将增殖培养中生长健壮的试管苗切除基部的愈伤组织，接种于事先配制好的生根培养基上，培养条件同增殖培养，每处理接种２０瓶，每瓶４棵，重复３次。生根培养１周后，每隔２ｄ观察记录各处理的生根数量及根的生长情况。

２结果与分析

２．１６－ＢＡ和ＮＡＡ浓度及配比对滇杨不定芽增殖的影响

增殖培养基中添加不同浓度的６－ＢＡ和ＮＡＡ，３０ｄ后各处理不定芽的增殖情况和试管苗的生长情况见表1。６－ＢＡ和ＮＡＡ对滇杨不定芽的增殖系数和试管苗的生长有明显影响。在实验浓度范围内，当６－ＢＡ浓度一定时，ＮＡＡ浓度越高，滇杨不定芽的增殖系数越小，试管苗的生长情况越差；而ＮＡＡ浓度一定时，不定芽的增殖和试管苗的生长情况也随着６－ＢＡ浓度的增加而变差，其中６－ＢＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ时，试管苗全部黄化死亡。处理１中滇杨不定芽的增殖系数和试管苗增高幅度均高于其他处理，且试管苗茎叶嫩绿色、腋芽抽生多、丛生芽多、苗高而健壮（图１），适合滇杨不定芽的增殖培养。

２．２ＮＡＡ浓度对滇杨试管苗的生根培养

将增殖后的试管苗转移到添加了不同浓度ＮＡＡ的生根培养基上进行培养，１０ｄ后观察统计各处理试管苗的生根率、主根条数、主根长度和须根长度（表２）。在不添加激素的培养基中试管苗也可以生根，但其根相对细长、瘦弱；但ＮＡＡ浓度过高也会导致生根率下降。当ＮＡＡ的浓度为０．０２ｍｇ／Ｌ时，所有试管苗均能生根，主根根短而粗壮，植株叶色浓绿、长势旺盛（图２）。

２．３滇杨试管苗的炼苗移栽

滇杨试管苗生根后，在室内开瓶放置５ｄ左右后移栽入经消毒处理的炼苗基质（河沙与腐殖土等体积混合）中进行炼苗，幼苗生长情况良好，其成活率可达９１．１％。

３结论与讨论

３．１增殖培养

在杨树的组织培养过程中，由于基本培养基的不同和培养材料基因型的差异，需要人为调节外源激素的种类及浓度，以获取最大的增殖系数。章林等［６］在对银中杨进行组培研究时发现添加０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ时嫩芽条上的腋芽不断分化与生长，具有较高的增殖率，但当６－ＢＡ与ＮＡＡ配合使用时，所有浓度的ＮＡＡ都使嫩茎的增殖率下降。而海燕等［７］在抗虫杨的组织培养过程中添加０．１、０．５ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，其对腋芽的萌发生长影响不大。在８４Ｋ杨的组织快繁研究中发现，较高浓度的６－ＢＡ可促进腋芽生长，但６－ＢＡ浓度过高不利于抽茎，而对丛状叶的增加有利，８４Ｋ杨腋芽增殖的最佳培养基为ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ。另外，细胞分裂素与生长素搭配使用对腋芽的增殖效果均优于其单独使用，适宜的６－ＢＡ与ＮＡＡ浓度配比可提高出芽率［８］。而本研究在ＭＳ培养基中添加较低浓度的６－ＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）和ＮＡＡ（０．０２ｍｇ／Ｌ），获得了较高的增殖系数，这可能与滇杨易于无性繁殖有关［１，９］。而张春霞等［１０］以滇杨叶柄为材料成功分化出不定芽，以１／２ＭＳ为基本培养基，添加０．００１ｍｇ／ＬＴＤＺ＋０．０１ｍｇ／ＬＮＡＡ，同样获得了较好的增殖效果，可见不同杨树组培中激素及其浓度的选择不可一概而论，应根据其具体的生理生化特性来确定。

３．２生根培养

研究表明，生长素是诱导试管苗生根的重要因素，其影响酶的活性、增加原生质的透性、使代谢活动加快、ＲＮＡ合成加强，从而有利于不定根的发生和生长。不同植物、不同基因型、同一植株的不同部位、不同年龄的试验材料分化根的能力不同［１１］。杨树的生根培养大都采用１／２ＭＳ为基本培养基，添加一定量的ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＩＢＡ。在山地杨的组织快繁中，１／２ＭＳ＋０．０５ｍｇ／ＬＮＡＡ培养基中的生根率可达１００％，但添加ＩＡＡ后的生根效果较差［１２］。林元震等［１３］在甜杨的组织培养和快速繁殖研究中发现，采用改良的１／４ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬＩＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ进行生根培养，生根率可达１００％，根数多且粗短。史绍林等［１４］在新西伯利亚银白杨的根诱导过程中发现ＩＢＡ与ＮＡＡ配合使用效果明显优于单独使用，但ＮＡＡ浓度过高易产生大块愈伤，１／２ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．０２ｍｇ／ＬＩＢＡ培养基中生根率达９０％，根数多且生长健壮。本研究发现１／２ＭＳ中添加０．０２ｍｇ／ＬＮＡＡ有利于滇杨生根，生根率可达１００％，与已报道的１／２ＭＳ＋０．０１ｍｇ／ＬＮＡＡ培养基最适合其生根有所差异［１０］，这可能与所用材料的内源激素水平不同等因素有关。

另外，滇杨试管苗培养１０ｄ左右即可生根，对于这种生根培养所需时间较短的植物，应考虑打破常规的生根培养模式，研究其简化的生根培养方法，以获得更加理想的效果。史绍林等［１５］在山新杨试管苗的生根培养中用一定比例的蛭石、草炭土、珍珠岩替代琼脂，用过滤自来水替代蒸馏水，混合培养基污染率很小且生根率达到９６％，这种方法有望替代传统的生根培养，以获得更多高质量、高成活率的植物幼苗。

参考文献：

［１］何承忠，张志毅，陈宝昆，等．滇杨遗传改良策略初论［Ｊ］．西部林业科学，２００４，３３（１）：４４－４８．

［２］何承忠，车鹏燕，周修涛，等．滇杨基因资源及其研究概况［Ｊ］．西南林学院学报，２０１０，３０（１）：８３－８８，９４．

［３］刘岩，周军，段安安，等．杨树组织培养的研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（４）：２１１６－２１１９．

［４］辛培尧，刘岩，段安安，等．滇杨不同外植体分化培养研究［Ｊ］．云南农业大学学报（自然科学版），２０１１，２６（６）：８２８－８３２，８６０．

［５］王蒂．植物组织培养［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０１０．２６．

［６］章林，陈建军，陆志民，等．银中杨组培快繁技术的研究［Ｊ］．吉林林业科技，２００３，３２（３），７－１０．

［７］海燕，何宁，康明辉，等．抗虫杨的组织培养［Ｊ］．河南林业科技，２００４，２４（４）：１３－１４．

［８］张静，林毅，蔡永萍，等．激素水平对８４Ｋ杨组培快繁的影响［Ｊ］．激光生物学报，２００５．１４（３）：２３３－２３７．

［９］韩燕，段安安，张晏，等．滇杨扦插繁殖试验初报［Ｊ］．西南林学院学报，２００９，２９（２）：８６－８８．

［１０］张春霞，樊军锋，黄建，等．滇杨的组织培养和植株再生［Ｊ］．植物生理学通讯，２００６，４２（６）：１１３１．

［１１］ＨＵＥＴＴＥＭＡＮＣＡ，ＰＲＥＥＣＥＪＥ．Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ：Ａｐｏｔｅｎｔｃｙｔｏｋｉｎｉｎｆｏｒｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Cｅｌｌ， Tｉｓｓｕｅａｎｄ Oｒｇａｎ Cｕｌｔｕｒｅ，１９９３，３３（２）：１０５－１１９．