茅莓总黄酮提取工艺的优化

刘德胜 郑红 韩景田

摘要：从茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）中提取总黄酮，采用吸光光度法测定提取液中总黄酮的浓度。在单因素试验的基础上采用Ｌ９（３４）正交试验考察乙醇体积分数、料液比、超声处理时间及提取温度对总黄酮提取率的影响。结果表明，茅莓茎中总黄酮最佳提取工艺条件为乙醇体积分数３０％、料液比１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）、提取温度８０ ℃、超声处理时间９０ ｍｉｎ，此工艺条件下茅莓茎中总黄酮提取率为４．７ ｍｇ／ｇ，此时叶中总黄酮的提取率高达１２．２ ｍｇ／ｇ，远高于根和茎中的。

关键词：茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）；总黄酮；提取工艺；优化

中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3295-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ

ＬＩＵ Ｄｅ－ｓｈｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｈｏｎｇ，ＨＡＮ Ｊｉｎｇ－ｔｉａｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｂｉｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ ２６４００３，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．， the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎes ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ ｗａｓ detected by ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ３０％； ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ８０ ℃； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ９０ ｍｉｎ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｒ． ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ ｓｔｅｍ ｒｅａｃｈｅｄ ４．７ ｍｇ／ｇ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｒ． ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ ｌｅａｆ ｗａｓ １２．２ ｍｇ／ｇ， ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｏｏｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）又名红梅消、天青地白草等，系蔷薇科悬钩子属落叶小灌木，生于山坡、路旁荒地、灌丛和草丛中，适应性强，分布于河北、山西、陕西、四川以及中南和华东各省，资源十分丰富［１］。茅莓为民间常用草药，其根、茎、叶均可作药用，具有清热凉血、止血、散结止痛、利尿消肿等功效［２］。茅莓含有皂苷［３，４］、黄酮［５］、酚酸类物质［６］、萜类［７］以及挥发油［８］等多种有效成分，其中黄酮类化合物具有良好的抗氧化性能，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老、增加机体免疫力、降血压、降血脂及抗肿瘤等功能［８］，茅莓的功效与其所含黄酮类化合物有着密切联系。本研究采用正交试验优化茅莓中总黄酮的提取工艺，以期为进一步综合利用茅莓资源提供参考依据。

１材料与方法

１．１材料与仪器

茅莓采自山东省烟台市昆嵛山国家级自然保护区，经滨州医学院中西医结合学院刘孟安教授鉴定为蔷薇科悬钩子属植物茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）。芦丁标准品（１０００８０－２００３０６）由中国药品生物制品检定所提供，AlCl3、甲醇、乙醇等均为国产分析纯。

ＴＵ－１９０１双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）；ＲＥ－５２Ａ旋转蒸发仪（上海亚荣生化设备仪器有限公司）；ＳＨＢ－ＩＩＩ循环水式多用真空泵、ＤＦ－１０１Ｓ集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；Ｄ２Ｆ－６０５０型真空干燥箱、ＰＨＧ－９２４６Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；ＨＹ４０Ｂ型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司）；ＥＬ２０４－电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；ＫＱ－４００ＤＢ型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ＷＤ－２１０５Ａ微型离心机（北京市六一仪器厂）。

１．２方法

１．２．１样品预处理将茅莓茎洗净后置烘箱中８０ ℃烘干、粉碎、过６０目筛，得试验用粉末样品，阴凉干燥处密闭保存。称取１００ ｇ样品，石油醚（沸程６０～９０ ℃）回流２～４ ｈ脱色素，进行多次脱色至石油醚无色，过滤，滤渣烘干。

１．２．２超声辅助法提取茅莓中的总黄酮称取预处理后的茅莓茎粉末１．０ ｇ，置２５０ ｍＬ三角瓶中，加入一定体积分数的乙醇，称重，设定超声功率和温度，超声处理一定时间后取出放至室温，称重，用相同体积分数的乙醇补充至原重。过滤，得茅莓总黄酮提取液。

１．２．３单因素试验以黄酮提取率为指标，设置单因素试验分别考察料液比、提取温度、超声处理时间、乙醇浓度的影响。①料液比。提取温度６０ ℃、超声处理时间９０ ｍｉｎ、乙醇体积分数５０％，料液比分别为１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同）。②提取温度。料液比１∶４０、超声处理时间９０ ｍｉｎ、乙醇体积分数５０％，提取温度分别为５０、６０、７０、８０ ℃。③超声处理时间。料液比１∶４０、提取温度７０ ℃、乙醇体积分数５０％，超声处理时间分别为３０、６０、９０、１２０ ｍｉｎ。④乙醇体积分数。料液比１∶４０、提取温度７０ ℃、超声处理时间１２０ ｍｉｎ，乙醇体积分数分别为２０％、３０％、４０％、５０％。

１．２．４正交试验采用Ｌ９（３４）正交试验考察料液比、提取温度、超声处理时间和乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响，因素与水平见表1。

１．２．5总黄酮含量的测定［９－１１］①标准曲线的绘制。精确称取干燥至恒重的芦丁对照品，用无水甲醇配成浓度为１４０．０ μｇ／ｍＬ的对照品溶液，准确吸取对照品溶液０．０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ分别置于１０ ｍＬ容量瓶中，加１０ ｇ／Ｌ AlCl3溶液０．５ ｍＬ，摇匀，放置１５ ｍｉｎ，以无水甲醇定容至１０ ｍＬ，以空白作为对照，１５ ｍｉｎ后于４２５ ｎｍ波长处测定吸光度。得到吸光度（Ａ）对浓度（Ｃ//μｇ／ｍＬ）的回归方程Ａ＝３２３．２８７ ６４Ｃ－０．７７０ ４６，Ｒ２＝０．９９９ ８，线性范围为１.４～１４.０ μｇ／ｍＬ。②样品中总黄酮含量的测定。取１ ｍＬ样品溶液于１０ ｍＬ容量瓶中，按标准曲线的绘制方法显色，测定吸光度。根据回归方程求出提取液中总黄酮的浓度，并利用下式求出总黄酮提取率。

Ｗ＝Ｃ×Ｎ×Ｖ／ｍ×１０－３

式中，Ｗ为总黄酮的提取率（ｍｇ／ｇ），Ｎ为稀释倍数，Ｖ为提取液总体积（ｍＬ），ｍ为茅莓茎的质量（ｇ），Ｃ为总黄酮提取液的浓度（μｇ／ｍＬ）。

２结果与分析

２．１单因素试验结果

２．１．１料液比对茅莓总黄酮提取率的影响由图１可知，随着提取剂乙醇用量的增加，茅莓总黄酮提取率先增加，料液比为１∶４０时总黄酮提取率最高。当黄酮类物质完全溶出之后，再加大提取剂的用量，总黄酮的提取率略有下降，且不利于后期的产物浓缩和提纯。

２．１．２提取温度对茅莓总黄酮提取率的影响由图２可知，总黄酮提取率随着提取温度的升高而升高，但提取温度高于７０ ℃时，提取率随温度升高而升高的趋势变得平缓。较高的提取温度有利于有效成分的溶出，但过高的温度会引起总黄酮的降解，反而降低提取效率。

２．１．３提取时间对茅莓总黄酮提取率的影响由图３可知，茅莓总黄酮提取率随着提取时间的延长而呈升高趋势，提取时间由５０ ｍｉｎ延长至６０ ｍｉｎ时，提取率的上升幅度较大。但当提取时间长于６０ ｍｉｎ时，提取率随时间延长而升高的幅度较小。

２．１．４乙醇体积分数对茅莓总黄酮提取率的影响由图４可知，总黄酮提取率随提取溶剂乙醇体积分数的增加呈先升高后降低的趋势。乙醇体积分数为４０％时提取率最高，过高或过低的提取剂浓度都不利于总黄酮的溶出。

２．２正交试验结果

正交试验结果见表２。由表２可知，４因素中料液比对黄酮提取率的影响最大，提取温度和乙醇体积分数次之，超声处理时间的影响最小。方差分析结果表明，料液比、提取温度和乙醇体积分数对茅莓茎中总黄酮提取率的影响显著，而超声处理时间对总黄酮的提取率没有显著影响。茅莓总黄酮提取的最佳工艺条件为Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ１，即料液比１∶５０，提取温度８０ ℃，超声处理时间１２０ min，乙醇体积分数３０％。由于超声处理时间对总黄酮提取率的影响不显著，从节约试验成本简化操作的角度考虑，在实际操作中选用９０ ｍｉｎ的处理时间。在此条件下总黄酮的提取率为４．７ ｍｇ／ｇ，高于其他试验组合。按此条件进行验证试验，从茅莓茎中提取总黄酮，重复３次，总黄酮的提取率分别为４．８、４．７、４．６ ｍｇ／ｇ，说明正交试验结果是可靠的。

２．３茅莓不同部位总黄酮含量的测定

精确称取干燥的茅莓根、茎、叶粉末各１．０ ｇ，按正交试验优化后的工艺提取总黄酮，根、茎、叶中总黄酮的提取率分别为４．２、４．７、１２．２ ｍｇ／ｇ，表明茅莓的叶片中总黄酮的含量和提取率远高于根和茎中的，可作为茅莓总黄酮提取的主要取材部位。

３结论

通过单因素试验和正交试验，优化得到茅莓茎中总黄酮的提取工艺为料液比１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）、提取温度８０ ℃、超声处理时间９０ min、乙醇体积分数３０％，此时茅莓总黄酮提取率最高，为４．７ ｍｇ／ｇ。提取工艺稳定性和重复性好、简单可行、省时节能，适于工业化生产。茅莓叶中的总黄酮含量和提取率远高于根和茎中的，这为茅莓资源的利用和进一步开发提供了依据。

参考文献：

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